大鼠腹主动脉缩窄术致大鼠慢性心衰的建模与体会

基金项目：广东省科技计划项目（编号：2013B022000103）
朱林强 周永焯 赖洪珍 吕敏仪 谢晓明 张银霞：广州医科大学金域检验学院 广东广州 510000
陈盛强：广州医科大学附属第二医院 广东广州 510000
许 卫 伍金雷 陈晞明：广州医科大学附属第三医院 广东广州 510000
通讯作者：陈晞明

大鼠腹主动脉缩窄术致大鼠慢性心衰的建模与体会

朱林强 周永焯 谢晓明 赖洪珍 吕敏仪 张银霞 陈盛强 许 卫 
伍金雷 陈晞明THE CONSTRUCTION OF RAT CHRONIC HEART FAILURE MODEL INDUCED WITH ABDOMINAL AORTIC COARCTATION
ZHU Linqiang, ZHOU Yongzhuo, LAI Hongzhen, et al

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  【摘 要】 目的 采用腹主动脉部分缩窄术建立大鼠慢性心力衰竭模型，评价慢性心力衰竭建模效果。方法 将大鼠随机分为A、B两组，各24只。A组行腹主动脉部分缩窄术，B组仅分离腹主动脉而不缩窄，术后每日观察大鼠的精神状态及体重等一般情况的变化。分别于术后第4周、第8周末行超声心动图检查，以评价大鼠的心功能改变，并于第8周末取心脏组织进行HE染色、马松染色观察心肌组织结构改变及心肌纤维化改变。结果 术后1周A组大鼠存活18只，死亡6只，存活率为75%，B组全部存活；建模四周后A组大鼠出现毛发稀疏、蓬松、干燥无光泽,活动力降低,呼吸频率加快,体重增长缓慢等变化，而且这些变化随建模时间增长而愈加明显，到8周时出现明显心力衰竭体征；建模4周后心动图检查结果：A组大鼠心脏收缩末期左室后壁厚度（LVPWs）、舒张末期左室后壁厚度(LVPWd)、收缩期室间隔厚度（IVSs）、舒张末期室间隔厚度(IVSd)均增加，其差异有统计学意义（p<005）, 左心射血分数（LVEF）有下降趋势但无统计学意义（p>005）；建模8周后A组大鼠LVPWs(0297±0020 vs 0374±0023)、p<005，LVPWd（0192±0009 vs 0290±0028）mm、p<005 ,IVSs（0311±0008 vs 0364±0012）mm、p<005，IVSd(0187±0008 vs 0225±0023)mm、p<005,LVEF(86586±1452 vs 60630±2716)mm、p<005，均差异明显（p<005）；HE染色结果和马松染色结果显示A组大鼠心肌细胞体积增大、数量减少、细胞排列紊乱、间隙增宽、细胞核浓染增大、染色不均、心肌肌节增多、肌纤维间质胶原纤维增生。结论 腹主动脉部分缩窄术可在8周时间成功建立大鼠慢性心力衰竭模型，且稳定性高，重复性好，是研究慢性心力衰竭的理想建模方法。
  【关键词】 腹主动脉缩窄术,SD大鼠,慢性心力衰竭
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.10.007

  慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是多种心血管疾病的最终归宿,严重影响着患者的生活质量和健康水平，它给家庭和社会带来了沉重的经济负担和精神痛苦，CHF现已成为全世界严重的公共卫生问题［1］。因CHF相关实验研究不能直接在病人身上进行，故CHF动物模型越来越广泛的被应用于实验研究中。所以建立一种稳定、可靠的动物心衰模型对进一步研究该类疾病有重要意义。现今众多CHF模型建立方法中，腹主动脉缩窄术因经济、实用、操作简单而成为CHF实验研究的常用模型。本组参照Anned等［2］腹主动脉缩窄术制备大鼠压力超负荷性慢性心力衰竭模型［3］，从建模步骤、超声心动图结果、心脏病理结构等方面评价此方法的可行性，并就如何建立稳定可靠的大鼠心力衰竭模型步骤展开讨论。
     1 材料和方法
1.1 实验动物
     八周龄健康雄性SD大鼠共48只，购于广东省医学实验动物中心（SPF级，动物编号：SCXK(粤)2013-0002），于广州医科大学医学实验动物中心适应性饲养两天（清洁级），体重220~270 g。随机分为A、B两组（A组24只，为模型组；B组24只，为对照组）。所有实验动物以标准大鼠饲料饲养，自由摄食饮水，温度23~25 ℃，湿度55％~70％。
1.2 实验步骤
1.2.1 术前准备
1.2.1.1 术前8小时禁食，自由饮水。
1.2.1.2 保持实验室室温为25~30 ℃，术中使用落地手术灯为手术提供光源，同时利于维持大鼠正常体温。
1.2.2 详细操作
1.2.2.1 大鼠用10%水合氯醛（035 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰卧位，固定四肢，腹部手术区备皮，消毒，并铺一次性无菌纱布。
1.2.2.2 于剑突下2~3 cm，腹正中切口，沿腹白线逐层切开皮肤及肌肉至剑突，暴露腹腔。
1.2.2.3 用手指在大鼠左侧背部向腹腔轻推，将胃体、脾脏一并挤出，外翻置于生理盐水湿润的纱布之上，固定，随后用脱脂棉球将左侧肝脏向上轻推，充分暴露腹膜以及左侧肾脏。
1.2.2.4 视野可见明显的左肾静脉，于肾静脉水平沿腹主动脉上15~2 cm处可用手指触及明显搏动感，用两只弯镊在此轻缓钝性分离，剥离腹主动脉血管鞘，分离腹主动脉，随之在其下穿过长约8 cm的4~0手术缝线（术前置于生理盐水中湿润），留置备用。
1.2.2.5 将磨钝的7号针头与腹主动脉平行紧贴血管放置，用留置的4~0手术缝线将腹主动脉与7号针头一起结扎，结扎后马上可触及结扎处下方动脉脉搏明显减弱、左肾缺血变白（见图1），迅速提起两边缝线同时轻柔的抽出针头，剪去过长的缝线。

 

蓝色箭头所指即为肾脏，图A：结扎前肾红润，图B：结扎后肾苍白

图1 腹主动脉缩窄前后肾的血供对比
1.2.2.6 检查大鼠腹腔内无残留纱布、棉球后，将胃体、脾等小心放回腹腔复位，逐层缝合肌肉和皮肤，消毒。
1.2.2.7 空白对照组大鼠按手术操作分离腹主动脉并穿线，但不做缩窄处理，缝合，消毒。
1.2.2.8 全部大鼠于术后肌注50 000 U/只青霉素抗感染，连续注射3天。术后密切观察并记录大鼠生存情况、体重以及精神状态、呼吸，饮水饮食、毛色、活动力等临床表现。
1.3 大鼠彩色超声心动图检查
     大鼠造模后4周、8周各行一次，10%水合氯醛（035 ml/100 g)腹腔注射麻醉后取仰卧位固定大鼠，备皮，运用超声诊断仪，胸骨旁左室长轴切面及腹主动脉长轴切面，检测大鼠：LVPWs，LVPWd，IVSs，IVSd，LVEF。
1.4 大鼠灌注固定取心脏组织，制石蜡切片，行HE染色、马松染色
     大鼠建模8周后，用10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定，开胸腔暴露心脏，灌注针头从心尖进入，固定在升主动脉，剪开右心耳，4 ℃生理盐水灌流3 min，再用4℃多聚甲醛灌注固定40 min，固定完毕取大鼠心脏送病理科做石蜡切片，常规HE染色、马松染色。
1.5 统计学处理
     所有实验数据以均值±标准差（±s）表示，采用SPSS 190统计软件进行分析，组间计算采用两独立样本T检验，以p<005有统计学意义，p<001为统计学有显著差异。
     2 结果
2.1 大鼠分组建模成功率及术后观察结果
     建模后1周共存活大鼠42只，其中模型组大鼠成活18只，死亡6只，成活率为75%，其中一只下肢活动不便，疑为缩窄动脉后下肢血流灌注不足所致，弃去不用；2只死于术后，解剖未见明显感染，无腹腔积液；4只死于术后72 h围手术期，解剖未见异常，疑为手术应激［4］，对照组全部存活。
     与对照组相比，模型组大鼠出现鼠毛蓬松、稀疏、干燥无光泽，活动力降低，呼吸频率加快，体重增长缓慢等表现，且上述表现随建模时间增长而愈加明显；到8周时可出现呼吸急促、对外界刺激反应迟钝、尾巴紫绀和轻度水肿等心力衰竭体征，表明模型组大鼠心功能下降，全身组织血液灌注减少，有缺血缺氧症状。
2.2 建模4周与8周超声心动检查结果
     建模4周后A组大鼠LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd均增加（p<005）, LVEF虽有下降趋势，但无统计学意义（p>005），结果见表1，结果提示在建模4周后大鼠已经出现心室肌肥厚的改变，但未达到心力衰竭。建模8周后LVPWs(0297±0020 vs 0374±0023)mm、p<005，LVPWd（0192±0009 vs 0290±0028）mm、p<005,IVSs（0311±0008 vs 0364±0012）mm、p<005，IVSd(0187±0008 vs 0225±0023)、p<005, LVEF(86586±1452 vs 60630±2716)、p<005, 此时差异更加明显，LVEF出现统计学差异（p<005），见表1,结果提示心脏逐渐失去代偿能力，转向心力衰竭；同时通过腹主动脉B型超声超成像可见模型组大鼠腹主动脉缩窄明显，220~270 g的大鼠使用7号针头缩窄后腹主动脉缩窄可达60%~70%；而对照组大鼠心脏结构、射血分数均正常。对照组大鼠未见异常,见图2。

表1 两组大鼠血流动力学指标比较

（±s）

组别	n	时间(W)	LVPWs(mm)	LVPWd(mm)	IVSs(mm)	IVSd(mm)	LVEF(mm)
B组	24	4	0.276±0.005	0.171±0.008	0.278±0.007	0.167±0.004	90.483±1.832
		8	0.297±0.020	0.192±0.009	0.311±0.008	0.187±0.008	86.586±1.452
A组	17	4	0.355±0.0151)	0.264±0.0121)	0.327±0.0601)	0.228±0.0131)	81.600±1.3112)
		8	0.374±0.0231)	0.290±0.0281)	0.364±0.0121)	0.225±0.0231)	60.630±2.7161)

 注：收缩末期左室后壁厚度（LVPWs），舒张末期左室后壁厚度(LVPWd)，收缩期室间隔厚度（ IVSs），舒张末期室间隔厚度(IVSd),左心射血分数（LVEF）;本厚度是以胸骨左室长轴切面，以主动脉影为统一参照标准，测量各壁厚度;1）p<005， 2） p>005

 

（说明：图A、图C：B组大鼠腹主动脉，图B、图D：A组大鼠腹主动脉；红色箭头所示为建模时缩窄部位）

图2 腹主动脉B型超声成像缩窄效果及血流对比
2.3 HE染色病理结果
     图中心肌组织细胞核均被染成蓝色，细胞质、胶原纤维、红细胞均被染成红色。A组大鼠心肌细胞体积增大、数量减少、间隙增宽、排列紊乱；胞核着色不均、心肌肌节增多、肌纤维间疏松水肿。B组心肌排列整齐，组织学表现正常。见图3。
2.4 马松染色结果
     图中蓝色部分代表心肌间质胶原成份，细胞质、心肌纤维、红细胞被染成深浅不一的红色。由图可见A组大鼠心肌间质胶原纤维增多，血管周围细胞外基质增多，图B、图D可见成片被染成蓝色的胶原纤维，将心肌分隔成岛状。见图4。

 

（说明：图A：B组大鼠心肌，图B：A组大鼠心肌)

图3 心肌HE染色结果（×400）
 

 

（说明：图A、图C：B组大鼠心肌；图B、图D：A组大鼠心肌）

图4 心肌马松染色结果（Ａ、Ｂ×200，Ｃ、Ｄ×400）
3 讨论
     动物CHF模型建立的方法有多种，常用的有以下三种［5-6］：①容量超负荷建模（包括动静脉造瘘法，腔静脉缩窄与主动脉瓣和二尖瓣关闭不全法）；②压力超负荷建模（包括主动脉缩窄和肺动脉缩窄法）；③化学因素造成（主要有采用阿霉素法）。以上几种方法都存在一定的局限性，例如操作精确度不高或者建模一定时间后动物之间心衰程度有较大差别等［7-8］。除此之外，近年来芦玲巧［9］等人使用主动脉弓缩窄术制备大鼠CHF模型以及张冬颖［10］等人使用冠脉结扎术建立该模型，相比本课题组采用的腹主动脉缩窄术达到理想心力衰竭状态的耗时较短，但其手术操作复杂、大鼠术后死亡率高，且必需呼吸机支持。
     心室重构是CHF的病理生理基础，超声心动图检查心脏功能、评价心力衰竭等方面具有无创伤，动态监测方便等优点［15］ 。本实验用超声心动图、HE染色和马松染色下心肌病理变化反映大鼠心室重构。可见建模8周大鼠有显著的心室壁增厚肥大、心腔扩大；组织学上表现为心肌细胞肥大、排列紊乱、间质增生、心肌间质纤维化、间隙增宽、细胞核浓染增大、着色不均、心肌肌节增多、肌纤维间疏松水肿等特点。此外，结合临床水肿发绀等症状，可知按照此方法可以较稳定的制备出大鼠慢性心力衰竭模型，并由手术操作简易、术后大鼠存活率高以及8周后大鼠CHF表现，可知本方法是一种较理想的CHF模型建立方法。
     采用腹主动脉部分缩窄术时，大鼠腹主动脉缩窄后肾血流量显著减少，激活RAAS系统并造成体内钠水潴留，加重心衰［11］。一方面增加压力后负荷，另一方面通过减少肾血流量致钠水潴留、增加前负荷，血管紧张素转化酶（ACE）激活增加使AngⅠ转化为AngⅡ，后者可使血管强烈收缩，加重心脏后负荷，引起心肌重构，形成恶性循环［12］。故本建模方法尤其适合研究由压力负荷过大而致的心肌肥厚并且从心衰代偿期到失代偿期病理及临床表现的变化，并通过腹主动脉的机械性缩窄直接导致心脏射血的后负荷增加，从而形成了不易受药物影响的稳定的高血压，更利于研究从高血压致心肌肥厚并转变成慢性心力衰竭的各种病理改变，与临床有较好的相关性［13-14］。因此，腹主动脉缩窄术致动物心力衰竭模型值得推广使用。
     本课题组采用腹主动脉缩窄术制备大鼠CHF模型，根据建模的效果思考总结，得出建模过程中的注意事项：
     ① 术前8小时禁食，否则手术中鼓胀的胃体会影响分离腹主动脉的手术视野，胃附近连着脾处有大量血管，在隔离过程中也容易损伤导致大出血。
     ② 开腹时要逐层剪开，避免伤到小血管造成出血。同时在剪开最后一层时需要用镊子提起来再剪，防止锋利的剪刀直接剪破内脏。
     ③ 暴露手术视野时，肠管、胃体、脾的隔离固定需用经生理盐水湿润过的纱布，同时在手术中注意保持湿润。若肝叶挡住视野可放置小棉球进入腹腔顶住肝脏使不其下垂，但切记放入小棉球位置和数量，方便术后取出。
     ④ 分离腹主动脉动作要轻柔，注意避开附近小的血管，防止术中出血，出血一方面影响手术视野，同时也降低手术后成活率。另外，不必分离过长腹主动脉，可容4-0手术缝线顺利穿过即可。
     ⑤ 结扎松紧度的判断：腹主动脉结扎的松紧程度是缩窄程度的重要影响因素，结扎紧后立即可观察到如图1左肾明显缺血变白，结扎后向外轻拉针头，以针头有明显阻力，不向外滑脱为宜。
     ⑥ 结扎部位的选择：结扎部位需谨慎，多在左肾静脉水平沿腹主动脉向上15~2 cm处将腹主动脉于7号针头共同结扎，结扎点选择过上会增加分离腹主动脉难度且在分离过程中易损伤膈膜导致气胸；结扎点过低则可能结扎在右肾动脉分叉处以下，则不能导致大鼠心脏后负荷明显增加而难以造成心力衰竭。
     ⑦ 术后肠粘连肠梗阻的预防：术前备皮需尽量清理干净，防止开腹后鼠毛进入腹腔。术前洗去乳胶手套上滑石粉后进行手术操作，术前准备湿润纱布铺于切口左侧，术中需用生理盐水保持外露肠胃湿润，术后确认放置进腹腔的棉球全部取出后自然复位胃、脾和肠管。
     ⑧ 大鼠麻醉后体温下降，故术中和术后都需注意保暖。
     ⑨ 术后可喂养8小时糖盐水（4%葡萄糖、0.9%氯化钠），同时观察大鼠是否有排便腹胀等情况以便确认是否有肠粘连梗阻，并需勤换饲养垫料，保持自然环境清洁。
     ⑩ 对4周及8周建模大鼠行超声时需要麻醉固定，但由于八周时大鼠心功能不全，建议减量注射麻醉药，以防麻醉过深导致大鼠意外死亡。

参考文献
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