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综合因素对肠易激综合征动物模型造模的影响

【】2015-05-19 点击次数
基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:81073160);广东省自然科学基金项目(编号:S2012010010539) 
闫 雪 唐洪梅 张庆业 李得堂 何嘉仑 廖小红 :广州中医药大学第一附属医院 广东广州 510405 

综合因素对肠易激综合征动物模型造模的影响

闫 雪 唐洪梅 张庆业 李得堂 何嘉仑 廖小红
A COMBINATION OF FACTORS INFLUENCE ON IRRITABLE BOWEL SYNDROME ANIMAL MODEL OF MODELIN 
YAN Xue, TANG Hongmei, ZHANG Qingye, et al 


  【摘 要】 目的  建立肠易激综合征综合因素动物模型,并与单因素模型比较。方法  将SD大鼠分为母婴分离组、肠道化学刺激组、束缚刺激组、综合因素组、空白组,五组动物分别进行一般状况及大鼠体重测试、排大便情况评估、直肠敏感性测试、肠道推进测试,并进行常规HE染色及5-HT检查。结果  在一般状况及大鼠体重测试中束缚组、母分组IBS模型大鼠体重有略微下降,其中醋酸组与综合因素组的体重明显低于空白组,综合因素组与母分组的活跃程度低,束缚组与醋酸组的活跃程度稍低;在排大便情况评估中各因素组与空白组比较均有显著性差异(p<0.05),其中束缚组的粪便点数最高为5.7±1.3,醋酸组、综合因素组其次分别为5.0±3.0、4.0±1.0,母婴分离组的影响最小为3.3±0.7;与空白组的腹部回缩反射(AWR)测试比较综合因素组(72±10)、母分组(69±3)、醋酸组(67±12)、束缚组(64±6)均有显著性差异(p<0.05);肠道推进测试中各因素组与空白组的肠墨汁推进率比较均有显著性差异(p<0.05),综合因素组的推进率最高达到72.56%,束缚组、母分组、醋酸组分别为67.97%、67.27%、56.25%;HE染色检查结果显示,各组别IBS大鼠模型的的局部组织均无明显的炎性浸润;5-HT检查表明各因素组与空白组的5-HT阳性指标比较均有显著性差异(p<005),综合因素组的5-HT(结肠0.5、直肠0.8)虽然也较空白组(结肠0.1、直肠0.2)有明显增加,但是仅稍优于母分组(结肠0.2、直肠0.4),明显低于束缚组(结肠1.1、直肠1.6)和醋酸组(结肠1.2、直肠1.7)。结论 综合因素大鼠造模成功,与各单因素动物模型比较综合因素组并没有表现出明显的差异,而综合因素组更加贴近肠易激综合征临床上多病因、发病机制复杂的情况,在此方面大大优于单因素动物模型。 
  【关键词】 IBS 动物模型 综合因素 
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.04.006 

  肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一种原因不明的以腹痛或不适及大便习惯改变为特征的慢性肠功能紊乱性疾病[1]。由于疾病的上述特点,造成IBS动物模型研制困难。至今没有有效治疗IBS的中成药批准上市,主要是因为缺乏稳定可控的动物模型基础平台。本实验建立一个综合因素IBS模型,并通过与现行单因素IBS模型作比较,探讨是否优于现行的模型及其影响。以母乳分离、肠道刺激、束缚刺激为造模的单因素,将三者结合,制定出综合因素模型组,将综合因素动物模型与单因素IBS模型进行比较,分析该造模方法的优缺点。
1 仪器与试药
1.1 动物
     出生少于2天的SD大鼠4窝,SPF级(购自广东省医学实验动物中心,合格证号:2008A010) 
1.2 药物及试剂
     石蜡油:泰兴科学仪器经营部,批号:20080604-2;醋酸:广州化学试剂厂,批号:20080202-2;乙醚:广州化学试剂厂,批号:20071205-1;实验试剂10%缓冲甲醛:40%甲醛10 ml,0.01 mol/L的PH7.4的PBS90ml,苏木素,伊红。
1.3 仪器
     血压计(型号:GB3053-93)电子分析天平(型号:BP211D) ;Leica脱水机、包埋机、切片机、染色机。
2 动物分组与造模方法
     出生少于2天的SD大鼠5窝,每窝作为一组,每窝8只乳鼠与其母鼠一同饲养,第25天雄鼠和雌鼠分笼饲养,母鼠单独饲养,到第6周再开始测试指标。
2.1 母婴分离组[2] 从出生第2天开始到第21天(上午),每天母婴分离180 min,乳鼠单独置于一个笼,第22天起正常饲养,到第6周再开始测试。
2.2 肠道化学刺激组[3-4] 实验幼鼠(n=10)从第8~21天,将幼鼠用乙醚麻醉后,用自制的直肠刺激注射装置经石蜡油润滑后轻柔地插入肛门,在8~14天时插入约2 cm,在15~21天时插入约3 cm,每次插入稳定后,在幼鼠第8~14天注入1%的醋酸0.2 ml/次/天,第15~21天时注入1%的醋酸0.4 ml/次/天,注入醋酸后,注射管在肠内停留1~2 min,以免醋酸流出。
2.3 束缚刺激组[5-6] 第8~21天的大鼠(下午)腹腔注射30%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉,用纸带束缚前肩、前上肢及胸部,限制其搔抓头面部,但不控制其活动。自大鼠清醒后开始计时,束缚时间为2 h,每天1次,持续14 d。造模结束后2周内不进行任何操作,2周后再开始测试。
2.4 综合因素组 实验幼鼠(n=10)从出生第2天开始到第21天,每天按第2点方法进行母婴分离180 min。从第8天到21天,从第8天到第21天幼鼠母婴分离后放回母鼠同笼进行哺养至少3 h,按第3点方法进行醋酸刺激一次,再放回与母鼠同笼哺养至少1 h,然后按第4点方法进行束缚刺激2 h一次。
2.5 空白组 从第2~24天,母乳同笼正常饲养,第25天开始,母鼠和小鼠分离。
3 指标测试及结果
3.1 一般状况及大鼠体重测试 比较IBS幼鼠与正常幼鼠的毛发状况、饮食、睡眠、活跃程度等一般情况,母分组和综合因素组与空白组对比,大鼠活跃程度低,其他组与空白组对比活跃程度稍低。 
     在第35天、第49天、第63天鼠龄测试数据表明(见表1),IBS幼鼠和同龄空白幼鼠比较中,束缚组、母分组IBS模型大鼠体重有略微下降,其中醋酸组与综合因素组的体重明显低于空白组,表明多因素造模的大鼠生活质量变化较大,大鼠体重的降低较多。这与IBS患者生活质量下降,体重减轻的症状相符[7]。 

表1 五组大鼠三鼠龄测试平均体重评价

(g) 


分组
体重
  第35天 第49天 第63天 活跃程度
空白组 191 198 265 +++  
束缚组 166 192 215 ++  
醋酸组 149 193 215 ++  
母分组 164 153 205 +  
综合因素组 106 143 196 +  
 注:“+”表示活跃程度低,“+ +” 表示活跃程度稍低,“+ + +”表示活跃 
3.2 排大便情况评估 各组大鼠分别于造模结束后第14天,在笼内垫清洁滤纸,观察4 h内大鼠排便的粪点数。实验均在白天进行,从第6周开始每周测定一次,连续测定4周。见表2。 
  表2 五组大鼠三鼠龄测试粪便改变评价

(±s,n=8) 

分组 粪便点
空白组 1.3±0.7
束缚组 5.7±1.31)
醋酸组 5.0±3.01)
母分组 3.3±0.71)
综合因素组 4.0±1.01)
 注:与空白组比较:1)表示p<0.05有显著性差异 
  空白组大鼠粪质多为柔软的香肠状,各IBS模型组出现有软的团块或湿润的粪便。实验表明,从第35天鼠龄到63天鼠龄的测试表明,在跨度1个月的时间内,五组模型大鼠均表现有轻度腹泻的症状,证明各IBS模型组大鼠均有慢性腹泻。
     在本实验的各单因素动物模型组中,束缚组的腹泻症状最为明显,考虑应激刺激因素对此腹泻的影响最大,肠道化学刺激其次,精神因素的影响最小。综合因素组的粪便点数增加并非最多,少于醋酸组与束缚组。
3.3 直肠敏感性测试 在幼鼠鼠龄的第63天对各组幼鼠进行大鼠的腹部回缩反射(AWR)测试,将血压计、针管与自制指套气囊用三通管连接,用针管向气囊内打气时可以在血压计上读出气囊内压力。大鼠在自制的密封麻醉瓶进行乙醚麻醉后,把用石蜡油润滑后的气囊经肛门轻柔地插入约3~5 cm,气囊末端距肛门1 cm,用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起,固定气囊。大鼠苏醒后,将其放在特制的不能转身的透明塑料瓶内。5 min后待大鼠适应环境,在大鼠意识完全清醒的情况下逐渐打气扩张肠道,分别观察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的压力阈值。结果见表3。 
    表3 五组大鼠测试AWR阈值评价

(±s,n=8) 

组别 平均压力(mmHg)
空白组 77±5
束缚组  64±61)
醋酸组   67±121)
母分组   69±31)
综合因素组   72±101)
 注:与空白组比较:1)表示p<0.05有显著性差异 
  考虑不同人员对大鼠腹部抬起、背部拱起的判断标准不同,所以本实验中各组的评估由同一名人员进行。注气后,达到腹部抬起、背部拱起的的气囊扩张压力阈值各组间有显著差异,但本项测试中,综合因素的AWR阈值并不低于各单因素组的AWR阈值,说明本实验中的综合因素动物模型的肠道敏感性低于各单因素组动物模型。
3.4 肠道推进测试  胃肠道推进是评价胃肠动力和致泻、止泻作用的重要参数,用墨汁灌胃后一定时间内取出。在第70天鼠龄,模型大鼠禁食(不禁水)1天后,用5 ml的注射液连接上灌胃针头,给模型大鼠灌胃3 ml的活性碳墨水,15 min后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)处死大鼠,用手术剪立即取出整个小肠,浸入5%福尔马林液以终止蠕动,然后水洗,测量活性炭在小肠的移动距离,以占据幽门到盲肠末的小肠全长的百分率表示。结果见表4。 

表4 肠墨法推进率%测试结果

(n=8) 

组别 肠墨汁推进率%
空白组 62.96
束缚组 67.971)
醋酸组 56.251)
母分组 67.271)
综合因素组 72.561)
 注:与空白组比较:1)表示p<0.05有显著性差异 
  在本实验中,束缚组与母分组的大鼠模型推进率均高于空白组,表明应急刺激因素及精神因素对肠蠕动的影响明显。而醋酸刺激组其推进率没有空白组高,甚至低于空白组,考虑可能由于肠道化学刺激对肠蠕动能力造成一定的影响。 
3.5 病理学检查
     用水合氯醛把大鼠处死,分离结肠和直肠,使用脱水机和包埋机对大鼠标本进行石碏包埋。
3.5.1 常规HE染色 在大鼠的直肠和结肠标本完成包埋后,放进常规染色的操作步骤如下:二甲苯两缸脱蜡各8分钟;无水乙醇洗脱二甲苯1分钟×2次;95%→90%→85%酒精各1 min;自来水洗2 min;苏木精染色1~5 min,自来水洗1 min;1%盐酸酒精分化20 s,自来水洗1 min;1%稀氨水返蓝30 s,自来水洗1 min;伊红染色20 s~1 min,自来水洗30 s;85%、90%酒精各脱水30 s,95%、100%酒精两缸脱水各2 min;二甲苯三缸各2 min;中性树胶封片。
     光镜下观察模型大鼠结肠段和直肠段表面层完整,未发现有溃疡。结肠与直肠的表面层与粘膜层存在炎性细胞浸润的情况,主要变化如下:空白组:肠粘膜表面完整,未见糜烂及溃疡;粘膜上皮细胞及杯状细胞形态、数量正常;粘膜下层及浆膜层未见水肿及炎细胞浸润。母分组、束缚组:粘膜表面轻度糜烂,粘膜下层未见水肿,未见炎细胞浸润。醋酸组:肠粘膜表面轻度糜烂,粘膜下层水肿增厚,并轻度慢性炎症细胞浸润。综合因素组:肠粘膜部分萎缩变薄,腺体减少,粘膜下层轻度水肿。见实验附图1~图5。 

图1 空白组HE染色光镜观察图 
 

图2 束缚组HE染色光镜观察图 
 

图3 醋酸组HE染色光镜观察图 
 

图4 母分组HE染色光镜观察图 

 

图5 三因素组HE染色光镜观察图 
  结果表明,各组别IBS大鼠模型的的局部组织均无明显的炎性浸润,证明本实验所造腹泻型IBS动物模型并非炎性反应,符合临床诊断标准。
3.5.2 5-HT检查 按以上的方法将大鼠处死取标本后,脱水,包埋,用全自动免疫组化染色仪进行染色,计量5-HT的染色指数。免疫组化染色指数计算方法:以阳性指数(PI)作为免疫组化反应水平指标。染色强度和染色面积的乘积,即为阳性指数。染色强度:不着色为阴性,记为0分;染成浅黄色为+,记为1分;棕黄色为+ +,记为2分;棕褐色为+ + +,记为3分。染色面积:染色的细胞面积占总细胞面积的百分数。
     各模型组间5-HT染色比空白组明显增加,按5-HT阳性指数计数方法,各组的数据见表5。 

表5 各模型组大鼠5-HT阳性指标平均值

(n=8) 


   分组
5-HT阳性指数平均值
  结肠 直肠
空白组 0.1 0.3
束缚组 1.11) 1.61)
醋酸组 1.21) 1.71)
母分组 0.21) 0.41)
综合因素组 0.51) 0.81)
 注:与空白组比较:1)表示p<0.05有显著性差异 
  由以上结果可见,各单因素组中由应激刺激和肠道化学刺激引起的模型组5-HT明显增加,而由于精神因素所致的IBS模型改变则不明显。综合因素组的5-HT虽然也较空白组有明显增加,但是仅稍优于母分组,明显低于束缚组和醋酸组。

4 讨论
     根据罗马Ⅲ—IBS的诊断标准,肠道没有组织性病变是诊断IBS的一个重要内容。常规HE染色是病理检查中用于炎性细胞检查的常用方法。所以本实验选择HE染色作为模型的一个评定指标。
     5-HT是一种与胃肠道活动关系密切的脑肠肽,目前已知胃肠道存在五种5-HT受体,这些受体除了对胃肠运动及分泌功能有影响外,对胃肠道感觉功能也有作用,大量研究表明腹泻型IBS患者的5-HT释放增加。在以腹泻为主的IBS患者血清和乙状结肠黏膜内已观察到5-HT浓度显著高于对照组。所以本实验选择此指标进行测定,作为IBS动物模型造模是否成功的指标之一。
     实验结果表明,综合因素组无论在大鼠的精神状况、体重、排便情况、直肠敏感性、肠推进运动还是病理方面的检测,都与空白组健康的大鼠有明显的差异,且符合肠易激综合征的诊断标准,说明综合因素大鼠造模成功。但是通过比较综合因素和各单因素动物模型,综合因素组并没有表现出明显的差异。而综合因素组更加贴近肠易激综合征临床上多病因、发病机制复杂的情况,在此方面大大优于单因素动物模型。

参考文献
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[7] 颜廷彦. 中西医结合治疗肠易激综合征临床研究[J]. 2009,2(18):59-60.


    
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