OGG1对PM2.5造成人肺上皮细胞DNA损伤的修复作用

基金项目：国家自然科学基金（编号：81172615）
杨拉维 王亚红 杨 腾 陈 婷 何惠娟 刘 刚：广东医学院附属医院 广东湛江 524001

OGG1对PM2.5造成人肺上皮细胞DNA损伤的修复作用

杨拉维 王亚红 杨 腾 陈 婷 何惠娟 刘 刚
THE REPAIRMENT OF OGG1 ON DNA DAMAGE OF HUMAN BRONCHIAL EPITHELIAL CELLS CAUSED BY PM2.5
YANG Lawei, WANG Yahong, YANG Teng, et al

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  【摘 要】 目的 研究碱基切除修复酶OGG1对PM2.5造成肺上皮细胞线粒体损伤的保护作用。方法 采集湛江市附属医院附近的PM2.5颗粒物，培养肺上皮细胞beas-2b，并转染OGG1过表达载体，以PM2.5 100 μg/ml 24 h 分别染毒正常和OGG1过表达的beas-2b细胞，DCFH染色后流式测定细胞内活性氧水平，单细胞凝胶电泳检测DNA损伤水平。结果 OGG1过表达后能显著抑制PM2.5造成的细胞内活性氧水平的升高，并能显著抑制PM2.5造成的beas-2b细胞DNA损伤。结论 OGG1能修复PM2.5造成的DNA损伤，该作用可能与其抑制ROS作用相关。
  【关键词】 大气污染物PM2.5,OGG1,活性氧ROS,DNA损伤

  【Abstract】 Objective To explore the repair mechanism of OGG1 on mitochondrial damage caused by PM2.5. Methods PM2.5 near the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College was collected. Human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) transfected with OGG1 overexpression vector were exposed to the PM2.5(100 μg/ml) for 24h. The level of intracellular reactive oxygen species was assessed by DCFH-DA staining. The DNA strand breaks were assessed by comet assay. Results OGG1 could inhibit the generation of reactive oxygen species induced by PM2.5. The OGG1 could alleviate DNA damage caused by PM2.5. Conclusion The base excision repair enzymes OGG1 alleviate DNA damage and this effect may be related to the role of ROS inhibition.
     【Key words】  Particulate matter 2.5 (PM2.5), OGG1, Reactive oxygen species (ROS), DNA damage
     【Author′s address】 Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, 524001, PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.08.002

  近年来，肺癌的死亡率日益升高，调查发现肺癌已经取代肝癌成为国际上恶性肿瘤死亡的第一大原因［1］。研究表明，大气污染物是肺癌的主要危险因素［2］,其中大气颗粒物是我国城市空气中的主要污染物之一。直径小于或等于2.5 μm 的细颗粒物(PM2.5)在大气颗粒物中占相当大的比重,约为70%，是空气中对人体健康危害最大的一类，随着工业的发展和机动车的增加，大气中颗粒物污染越来越严重,如果长期吸入颗粒物污染的空气,必将严重危害人类健康［3-4］。
     细胞自身代谢和外源性的刺激都产生活性氧(ROS)，ROS可损害各种细胞成分，包括蛋白质、脂质和核酸，大量的研究表明ROS能引起DNA氧化损伤［5-6］，DNA氧化损伤和癌症的发生是密切相关的。
     细胞内8-羟基鸟嘌呤(8-oxoG)是氧化损伤的产物之一，具有高的致突变性，8-oxoG与许多肿瘤的发生发展密切相关。细胞内特异识别并切除8-oxoG的酶称为8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶，简称OGG1［7-8］。OGG1基因位于人染色体3P25区域，属于管家基因［9］。OGG1基因编码产物OGG1蛋白是一个带有AP裂解酶活性的双功能DNA糖苷酶。研究结果表明OGG1的活性与肿瘤的发生密切相关［10-11］。
     本实验室前期研究了不同城市PM2.5的成分和细胞炎症的关系［12］，发现不同成分的PM2.5能诱导DNA损伤，研究了OGG1和肺癌的关系［13］，发现OGG1和肺癌有显著的相关性，因此，我们研究OGG1对PM2.5造成人肺上皮细胞DNA损伤的保护作用，并探讨可能的保护机制。
     1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
     （QJS-120F智能中流量多级颗粒采样器（锦州利诚），QJS-100中流量多级颗粒切割器（锦州利诚），CO2培养箱(Thermo 公司)，酶标仪（Thermo）, FACSCalibur 流式细胞仪（BD公司），共聚焦显微镜(Leica, Bensheim, Germany)，Beas-2b细胞，DMEM高糖（Hyclone），胎牛血清（杭州四季青），脂质体2000转染试剂盒(Jnvitrogen,USA)，MTT（Sigma），DCFH（Sigma），彗星实验检测试剂盒CometAssay Kit (Trevigen, USA).
1.2 PM2.5的采集和制备
     采集PM2.5使用QJS-120F中流量多级颗粒采样器，配置QJS-100中流量多级颗粒物切割器，采样地点广东医学院附属医院临床医学研究中心六楼，采样流量100 L/min，连续采集72 h。将载有PM25颗粒样品的纤维滤膜放入超纯水中, 超声振荡15 min 以洗脱颗粒物, 然后将样品真空冷冻干燥24 h, 称重, 加入一定量PBS 配制成储备液,高压灭菌，4 ℃保存，临用前震荡混匀。
1.3 细胞转染及染毒
     人肺上皮细胞（beas-2b）用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，于37 ℃、5%CO2条件下培养，细胞融合80%时用025%胰蛋白酶消化传代或用于实验。将前期研究已构建的OGG1过表达载体按照Lipofectamine 2000说明书操作，转染进beas-2b，并通过Western blot 检测beas-2b内OGG1表达水平。将正常beas-2b细胞和转染了OGG1过表达载体细胞分别正常培养到细胞融合80%时，分别加入终浓度为100 μg/ml的PM25，染毒24 h。
1.4 细胞内活性氧水平
     分别收集染毒后的细胞，0.25%胰酶消化离心收集细胞，用PBS漂洗两次，加入终浓度为5 μmol/L的DCFH-DA染色液，37 ℃作用30 min，PBS漂洗两次，流式细胞仪测定细胞内二氯荧光素的平均荧光强度，检测转染OGG1对细胞内活性氧水平的影响。
1.5 细胞DNA损伤的检测
     分别收集染毒后的细胞，用冰冷PBS重悬细胞到1×105/ml，按1∶ 10（体积比）将细胞（1×105/ml）和融化的低熔点琼脂糖LMA（37 ℃）混合，并取50 μl加到玻片孔，将玻片放入4 ℃冰箱避光10 min使LMA凝固，将玻片浸泡在裂解液中，置于冰上或4 ℃裂解30~60 min。甩干玻片多余的裂解液，将玻片浸入新制的解旋液中避光解旋20~60 min。加950 ml预冷的电泳液，将玻片放入玻片孔处，21 V，电泳30 min。将玻片取出置于水中5 min，两次，然后置于70%酒精中5 min，低于45 ℃下干燥10~15 min，加入100 μl 稀释好的SYBR Green到凝胶孔里，置于冰箱5 min，在室温避光干燥玻片，最后用荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察。
1.6 统计分析
     采用SPSS15.0软件进行分析，所有实验均重复至少3次。结果表示为(±SD)。2 结果
2.1 OGG1抑制PM2.5诱导的细胞内活性氧水平升高
     免疫印迹的实验结果表明OGG1过表达载体成功转染进了beas-2b细胞，并且编码OGG1蛋白的产生，使转染组细胞的OGG1蛋白水平明显高于未转染组。流式细胞仪的检测结果表明PM2.5能诱导细胞内ROS的水平升高，并且OGG1能够显著的抑制PM2.5导致的细胞ROS升高(p<0.01)(见图1)。这种对ROS的抑制能力可能和OGG1对8-oxoG切除能力相关。
2.2 OGG1抑制PM2.5诱导的DNA损伤
     单细胞凝胶电泳的实验结果表明PM2.5能够导致beas-2b细胞DNA的损伤，损伤可能是由于PM2.5诱导产生的细胞内高浓度的ROS所导致的，对比对照组，OGG1过表达能够显著的抑制PM2.5导致的DNA损伤(p<0.01)(见图2)。OGG1对DNA损伤的保护可能是同其抑制细胞内ROS作用相关。

 注：A：免疫印迹检测OGG1的表达。B：柱形图检测转然后细胞内OGG1表达量（vs NC* *p<001）。C：OGG1对PM2.5诱导细胞ROS抑制作用统计结果（结果重复三次）（vs NC+PM2.5,* *p<001)

图1 免疫印迹检测OGG1的过表达及OGG1对beas-2b细胞ROS的影响

 注：A：荧光显微镜拍摄单细胞凝胶电泳荧光图，彗星尾巴的长度和体积代表DNA损伤程度。B：彗星实验统计结果（结果重复三次），OGG1对PM2.5造成的beas-2b细胞DNA损伤具有显著的修复作用（vs NC+PM2.5 * *p<001）

图2 彗星实验检测OGG1对PM2.5造成beas-2b细胞DNA损伤的修复作用
3 讨论
     近些年来，随着工业的发展和机动车的增加，空气污染越来越严重。作为空气质量最重要的指标，PM2.5指数已经在全国各大城市实行了实时监测。国内最近统计研究表明，恶性肿瘤中肺癌的死亡病例数排第一位［14］，越来越多的研究表明，PM2.5与哮喘、肺癌等一系列的肺部疾病的产生存在相关性。本实验研究表明，PM2.5能够诱导细胞内活性氧的产生，能够导致细胞DNA的损伤，这与之前的研究报道一致［15-16］。不同来源的PM2.5的成分已经被研究得非常清楚，主要是多环芳烃(PAHs)和过渡金属元素［17］，随着对PM2.5研究的深入，如何保护机体、减少PM2.5对机体造成的损伤显得非常重要。
     OGG1是非常重要的碱基切除修复酶之一，在清除8-oxoG，保护细胞功能方面发挥重要的作用。研究表明细胞核中的OGG1的表达和蛋白活性都高于线粒体，线粒体中的氧化损伤和突变积累比细胞核更快。
     致癌物苯并芘Bap是多环芳烃的重要成分之一，有研究表明Bap能够降低OGG1的活性，诱导肺癌的产生［18］，也有研究表重金属导致的基因突变与OGG1的活性降低有关［19］，因此PM2.5的致癌很可能与PM2.5降低OGG1的活性相关。
     本研究表明，OGG1的过表达对PM2.5造成的DNA损伤有明显的修复和减轻作用，但对于该修复和保护作用的具体分子机制还没有研究清楚，可能是和清除细胞内的ROS、保护线粒体的功能相关，PM2.5是如何对线粒体造成的损伤以及OGG1保护线粒体功能的分子机制需要后续试验进行验证。而基于OGG1对PM2.5造成的DNA损伤有明显的修复和减轻作用，OGG1可能成为PM2.5导致的肺部疾病的一个治疗靶点。

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