疟原虫厚血膜染色方法的改良

唐琼华 梁志江 何伟业 杨平英：广州中医药大学第一附属医院
广东广州 510405

疟原虫厚血膜染色方法的改良


唐琼华 梁志江 何伟业 杨平英
IMPROVEMENT ON PLASMODIUM THICK BLOOD FILM STAIN METHOD
TANG Qionghua, LIANG Zhijiang, HE Weiye, et al

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  【摘 要】 目的 探讨一种简便、省时、易于掌握的疟原虫厚血膜的染色方法。方法 根据抗凝血标本血红蛋白的量的不同，将瑞氏染液和蒸馏水按比例配制成待用染液，通过多次染色试验寻找血红蛋白的量和染液配制比例之间的最适关系，以达到最佳的染色效果。结果 根据抗凝血标本血红蛋白的量将瑞氏染液和蒸馏水按研究中所提供的比例配制成血疟原虫厚血膜染液，染色10 min后冲洗晾干，按此方法染出的血疟原虫厚血膜背景干净，虫体清晰，易于分辨。结论 改良后的疟原虫厚血膜染色方法，染色效果理想，值得广泛推广。
  【关键词】 疟原虫,厚血膜,染色
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.09.030

  疟疾是由疟原虫感染人体而引起的一种恶性传染病，它广泛分布于热带和亚热带各国（尤其是亚非拉各发展中国家），据世界卫生组织报道，2010年在全球106个疟疾流行国家和地区，共有2.16亿疟疾病例，65.5万人死于疟疾［1］。且随着全球气候的变暖，这一寄生虫病正有向北迁移的趋势，有报道称美国研究人员于2012年在美国最北部的阿拉斯加州发现一例禽疟疾［2］。在我国，经政府的多年努力，国内疫情已得到基本控制，但仍不时有一些散在病例的发现，且多为输入性病例。为防止其在国内传播蔓延，对受感染者尽早地诊断和进行隔离治疗是非常有必要的。根据WHO的标准，实验室诊断是疟疾确诊的基础，目前实验室诊断疟疾的方法有厚、薄血膜显微镜检查法、快速抗原检测、PCR、离心分层定量分析法（Quantitative Buff Coat,QBC）和血清学检查等方法，其中显微镜同时检查厚血膜和薄血膜仍是诊断疟疾的金标准［3］。但此方法对实验室工作人员的要求较高，尤其是其中厚血膜的制作和染色较难把握，稍有不慎，极易因涂片过厚而导致溶血不完全或染色不佳。为找出一种便于掌握、效果较佳的厚血膜的制作方法，笔者与同事在长期的工作实践中，对血涂片查找疟原虫厚血膜的制作和染色进行了部分改良，在此与各位同行分享。
     1 材料和方法
1.1 实验材料
     EDTA-K2抗凝外周血标本，玻片，瑞氏染液（可自配或购买商品化试剂），吉姆萨染液，蒸馏水，OLYMPUS BX40型光学显微镜。
1.2 染色方法
1.2.1 取全EDTA-K2抗凝血标本，摇匀后用加样枪取10 uL抗凝血在干净玻片上涂开成一直径约为1.5 cm左右、厚薄均匀的圆形厚血膜，平放晾干。每份标本制成两张厚血膜片。
1.2.2 根据抗凝血标本血红蛋白的量将瑞氏染液和蒸馏水按比例配制成待用染液，其比例关系见表1。
1.2.3 制好的两张片中，一张按传统厚血膜染色法用吉姆萨染色，另一张则将按上面比例配好的染液混匀覆盖在已晾干的厚血膜上，染色10 min后用蒸馏水轻轻将液染冲走，玻片晾干待检。
1.2 重复性和稳定性验证
     随机选取5名实验室技术人员和5名实习同学接受此染色方法培训后，每人均用已知疟原虫阳性和阴性EDTA-K2抗凝血标本制备厚血膜4张（每份标本2张），并采用本方法配制染液和进行染色，制得40张厚血膜片，将此40张片改变顺序交由另两位形态学经验丰富的同事油镜下检查并评价，以评估此染色方法的稳定性和重复性。

表1 血红蛋白量与染液配制比例的关系

 

血红蛋白量	瑞氏染液∶ 蒸馏水
>90 g/L	1∶ 5
60~90 g/L	1∶ 3
<60 g/L	1∶ 1

2 结果
2.1 此改良后染色方法与传统的吉姆萨染色法染色效果的比较
     由图1和图2可见，改良后方法制作染色的疟原虫厚血膜片（油镜下）与传统方法制作染色的疟原虫厚血膜片（油镜下）相比，染出来的血膜在镜下背景干净，虫体清晰，易于分辨。两种方法比较结果见表2。

 

图1 传统方法制作染色的疟原虫厚血膜片（油镜下）

 

图2 改良后方法制作染色的疟原虫厚血膜片（油镜下）

表2 传统方法与改良后的染色方法比较

 

对比指标	传统方法	改良后
厚血膜脱落数	4张	2张
薄血膜脱落数	3张	1张
染色时间	20~30 min	10 min
细胞形态	胞质不清，有粘连	胞质清晰，少粘连
边缘形态	边缘不整齐	边缘整齐
疟色素	虫体结构模糊，颜色暗淡不清晰	虫体结构分明，颜色鲜亮
背景	背景模糊，疟原虫不易辨认	背景清晰，疟原虫易辨认
操作情况	复杂繁琐	简单快捷

2.2 重复性与稳定性的评估结果
     随机选取5名本科室实验室技术人员和5名实习同学采用此改良方法进行厚血膜染色，阴、阳性标本均染出了背景清晰，易于辨认的合格的厚血膜片。且5名本科室实验室技术人员和5名实习同学染的厚血膜片之间无显著差异，证明此染色方法重复性和稳定性好，易于掌握。
     3 讨论
     疟疾被WHO列为头号热带传染病，它是由疟原虫寄生于人体、经媒介按蚊传播、引起以周期性发冷、发热、出汗等症状和脾大、贫血等体征为特点的寄生虫病，分为间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟4种。疟疾的实验室诊断有病原学诊断（厚、薄血膜染色镜检找到原虫）、免疫学诊断（循环抗原抗体的检测）、分子生物学技术PCR和核酸探针检测三种方法，其中以病原学诊断（厚、薄血膜染色镜检找到原虫）最为可靠易行［4］。而在病原学诊断中，厚血膜法由于查找原虫所用血量多，虫体密集，阳性率远高于薄血膜法。但传统的厚血膜制作染色方法需要先用蒸馏水溶血后再采用吉姆萨染色法染色，步骤较多操作繁琐，不易掌握，对实验室工作人员的技术和经验要求较高，对于新手来说按此方法制作出一张满意的厚血膜并不容易，且此方法制作出的厚血膜镜下杂质较多，对于原虫的查找会造成一定的干扰，既延长了检测的时间，又容易造成漏检。也曾有同行试过采用染缸一步染色法染厚血膜［5］，但染缸法适合于批量染色，且若有血膜脱落易于造成标本间的污染。而经笔者改良后的方法将溶血与染色合为一步完成，每张血膜单独染色，无污染风险，步骤简单，操作方便，只需10 min，易于掌握，染出的厚血膜背景干净，虫体清晰，易于分辨。且此改良方法只用实验室常规血涂片采用的瑞氏染液即可，无需另行购置或配制吉姆萨染液，这样既为实验室缩短了疟原虫的检测时间，提高了检测的阳性率，又节约了检测成本，可谓一举数得。
     卫生部WS259-2006和美国CLSI M15-A标准中推荐的疟原虫厚血膜常规染色法(先溶血后染色)同样适用于锥虫和巴贝氏虫等其它血液寄生虫的检查［6］，但因本科无其它血液寄生虫阳性标本，尚无法证实此染色方法是否适用于锥虫等其它血液寄生虫。

参考文献
［1］ WHO.World malaria report 2011［R］.2011.
［2］ 新华社.研究称全球变暖导致禽疟疾北移［EB/OL］.(2012-9-20) ［2015-03-01］.http://tech.gmw.cn/2012-09/20/content_5134514.htm.
［3］ GILLES H M,WARRELL D A. Bruce-Chwatt’s essential malariology［M］. London: Arnold, 1993. 
［4］ 韦 林.疟原虫血液浓集法的改进［J］.临床检验杂志,2011,15（5）：267.
［5］ 王厚芳.疟原虫检查厚血膜染色方法的建立及临床应用［J］.中华检验医学杂志,2012,35（12）：1191.
［6］ 叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.3版.南京:东南大学出版社,2006:242-243.