聚集性诺如病毒感染事件的病原学检验

梁 飘 林 英 陈书华：阳江市公共卫生医院 广东阳江 529500

聚集性诺如病毒感染事件的病原学检验


梁 飘 林 英 陈书华
PATHOGENIC EXAMINATION OF AGGREGATIVE NOROVIRUS INFECTION INCIDENTS
LIANG Piao, LIN Ying, CHEN Shuhua

---

  【摘 要】 目的 探讨一起聚集性同时费聚集性的食物中毒（诺如病毒）的病原学检验方法。方法 收集2011年2月16日阳江市一中出现的疑似诺如病毒中毒的422例学生的样本，使用荧光RT-PCR的检验方法对所收集的学生样本进行核酸检验，并对核酸检验结果进行整理分析。结果 在本次研究中，422份学生样本中总共检验出205例诺如病毒GGII型出现群阳性的现象。结论 在本次研究中，导致422例学生出现腹泻、呕吐以及腹痛的主要原因为GGII型的诺如病毒中毒，在本次研究中对患者实施荧光RT-PCR的检验方法后，能够迅速准确对患者进行诊断。同时我们发现，在出现学生的腹泻以及呕吐等现象后，需要在接报后立即报告市疾控中心、市卫生计生局和省疾控中心，立即启动突发公共卫生事件应急预案，紧急召集应急行动分队，组织搜寻密切接触者并开展流行病学调查，通过这种形式能够较好的对学生实施治疗。
  【关键词】 聚集性诺如病毒,感染事件,病原体检验,荧光RT-PCR
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.07.035

  诺如病毒感染是一种较为常见的疾病，同时会呈现出一种爆发的趋势，对患者造成极为严重的危害，甚至极有可能会导致患者出现死亡的情况，造成极为严重的后果［1］。2011年2月16日，阳江市一中422例学生出现以呕吐、腹痛和腹泻等症状为主的聚集性疫情，市公共卫生医院接报后立即报告市疾控中心、市卫生计生局和省疾控中心，立即启动突发公共卫生事件应急预案，紧急召集应急行动分队，组织搜寻密切接触者并开展流行病学调查，取得较好的效果，现报道如下：
     1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 临床资料 病例临床症状：422个病例中，主要临床症状有腹痛，腹泻，呕吐和食欲不振，其中出现腹痛348例，腹泻275例，呕吐328例，不同性别间主要症状分布情况见表1。

表1 病例性别及临床症状的分布情况

(n)

症状		发病人数	占有该症状的 病例总数百分比（%）
腹痛	男	186	53.45
	女	162	46.55
腹泻	男	159	57.81
	女	116	42.18
呕吐	男	142	43.29
	女	186	56.71

1.1.2 标本资料 在本次研究中，收集所有学生的标本共422份，其中肛拭子392份，粪便标本30份，环境标本共60份。同时收集该学校中的厨房的砧板拭子50份，碟子的拭子12份，诺如病毒的临床阳性的标本作为临床对照组的样本，在本次研究中需要使用GGII型的诺如病毒的阳性临床标本，由广东省疾病预防控制中心提供的。
1.1.2 仪器 仪器使用荧光RT-PCR的检验方法中的Lightcycler II型的荧光定量PCR仪，收集ABI 9700型的PCR仪，保存标本的Thermo A2型的生物安全柜。同时需要使用Bio-Rad Powerpac电泳仪、Eppendorf 581R冷冻高度离心机、信号VL Infinity 100的凝胶成像系统。
1.1.3 试剂盒 ABI逆转录试剂盒、Qiagen RNA提取试剂盒、Roche Taq DNA 聚合酶以及Roche荧光PCR试剂盒。使用琼脂糖对诺如病毒进行保存。
1.2 方法
     使用Qiagen RNA提取试剂盒对于患者诺如病毒RNA实施提取，严格的按照相关要求进行。提取完成后，将产物在60 μl的DEPC水中进行备用处理。在处理完成后，使用RT-PCR试剂盒对患者的病毒标本实施逆转录反应，通过随机引法对患者进行cDNA处理，通过对患者构建出20 μl体系的方式对于患者实施相应的检查。整个反应保证在42℃的环境下进行30 min的反应。在进行荧光PCR的检查过程中，使用Roche荧光PCR试剂盒进行相应的压就，在临床进行研究的过程中，实施20 μl反应体系的构建工作，使用Lightcycler II型的荧光定量PCR仪进行相应的PCR的检查。反应环境在95℃的环境下实施10 min反应，此过程进行50个循环，循环形式为扩增形式。而在此过程中，对阈值进行相应的设定，超过阴性对照的扩增曲线的最高点。而在进行常规的PCR的检测过程中，本次研究可以实施50 μl反应体系构建工作，同时在此过程中也需要注意进行反应程序的扩增工作，整个反应过程的环境保证在94℃的环境下，反应时间3 min。
1.4 统计学方法
     将数据纳入SPSS17.0软件中分析，计量资料比较采用t检验，以（±s）表示，率计数资料采用2检验，以率（%）表示，p<0.05为差异有显著性，有统计学意义。
     2 结果
2.1 通过本次研究我们发现，荧光PCR的结果能够显示出相应的PCR扩增曲线，在本次研究中，临床对患者的检测结果如图1所示。

 

图1 荧光PCR显示的扩增曲线
  在本次研究中，所有患者在实施荧光PCR检验后，有一定数量的患者的PCR检测结果呈现出阳性的情况。同时需要使用2%的琼脂糖凝胶电泳的形式对患者实施检验结果分析，在临床分析完成后的结果如图2所示：

 

图2 PCR检测阳性结果的琼脂糖凝胶电泳分析
2.2 基因类型分布 见表1。

表1 阳性结果的基因类型分布

 

基因分型	各基因型毒株数量（例）	所占比例（%）
GII/4(2006b)	191	93.17
GII/4(2008variant)	10	4.87
GII/1	1	0.487
GII/5	1	0.487
GII/11	1	0.487

3 讨论
     诺如病毒（Norwalk Viruses，NV）又被称为诺瓦克病毒，是一种人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）的相关类型［2］。由于诺如病毒的特点，在临床上已经是世界急性病毒性胃肠炎呈现出一种爆发性增长的主要原因之一，同时也是目前造成儿童出现急性胃肠炎的主要原因之一［3］。诺如病毒是一种常见的单链RNA类型的病毒。有研究显示，诺如病毒通过对于其衣壳蛋白编码区的核苷酸以及氨基酸的序列特征进行相关的检验，又能够被分为5个不同的遗传组［4］。由于目前医学以及生物学的相关技术的不断发展，检测手段的不断完善，目前诺如病毒的危害以及对于人类身体健康的巨大危害已经开始得到了较多人群的重视［5］。同时在美国也有一项研究显示，每年由于诺如病毒死亡的患者约有300例左右，发病人数高达2300万，会对人类的身体健康造成极大的危害［6］。同时诺如病毒的发病会呈现出一种爆发的趋势，在英国、荷兰以及澳大利亚都有爆发发病的报道。
     诺如病毒并不能够使用细胞培养的方式进行培养，因此在本次研究中，我们使用荧光RT-PCR的检验方法对患者实施诊断。在本次研究中，为2011年2月16日市一中有422例学生出现以呕吐、腹痛和腹泻等症状为主的聚集性疫情。市公共卫生医院接报后立即报告市疾控中心、市卫生计生局和省疾控中心，并立即启动突发公共卫生事件应急预案，紧急召集应急行动分队，组织搜寻密切接触者并开展流行病学调查。在本次研究中，我们发现422份的样本中总共检验出205例诺如病毒GGII型出现阳性的现象，明确了导致422例学生出现腹泻、呕吐以及腹痛的主要原因为学生感染GGII型诺如病毒出现中毒的情况。而在本次研究过程中我们也发现，阳江市公共卫生医院在处置本次诺如病毒疫情的突发事件中，反应迅速，运作有序，措施有力，认真负责，充分体现出该中心对突发公共卫生事件的应急能力和处置能力，效果较好，在临床上值得推广应用。

参考文献
［1］ 靳 淼,孙军玲,常昭瑞,等.中国2006~2007年诺如病毒胃肠炎暴发及其病原学特征分析［J］.中华流行病学杂志,2010,31(5):549-553.
［2］ 陈冬梅,贾立平,张 又,等.医院内诺如病毒感染的三种病原学检测方法应用比较［J］.中华流行病学杂志,2007,28(3):218-221.
［3］ 李 晖,方 苓,邹丽容,等.广东省暴发性胃肠炎中诺如病毒的分子流行病学特点分析［J］.中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(1):5-8.
［4］ 王全意,窦相峰,高志勇,等.北京市春季诺如病毒性腹泻流行病学及病原学调查［J］.国际病毒学杂志,2008,15(6):161-164.
［5］ 张有江,程 明,侯建国,等.扬州地区急性散发性诺如病毒感染性腹泻的临床特点分析［J］.现代检验医学杂志,2014,(5):80-82.
［6］ 邓 莉,贾立英,钱 渊,等.北京地区婴幼儿诺如病毒与轮状病毒所致腹泻的临床比较分析［J］.中华流行病学杂志,2009,30(4):398-401.