乙酰唑胺对胸膜肿瘤小鼠水通道蛋白1的影响研究

基金项目：广州市卫生局医药卫生科技项目（编号：20131A010001）
刘宗师 张靖轩 杨 智：广州医科大学附属广州市第一人民医院 广东广州 510180
通讯作者：张靖轩

乙酰唑胺对胸膜肿瘤小鼠水通道蛋白1的影响研究


刘宗师 张靖轩 杨 智
EFFECT OF ACETAZOLAMIDE ON AQUAPORIN 1 IN MICE WITH PLEURAL TUMOR
LIU Zongshi, ZHANG Jingxuan，YANG Zhi

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  【摘 要】 目的 探讨乙酰唑胺对胸膜肿瘤小鼠AQP1表达及胸腔积液的影响。方法 建立胸膜肿瘤动物模型，随机分为肿瘤组和干预组,干预组每日一次经口灌注乙酰唑胺（40 mg·kg-1·d-1）。比较各组小鼠胸腔积液的量，采用荧光定量PCR和免疫组化的方法测定水通道蛋白1及其mRNA的表达。结果 胸膜肿瘤小鼠胸腔内见血性积液及肿瘤结节生长，干预组小鼠胸水量较肿瘤组减少，免疫组织化学染色显示AQP1表达于胸膜壁层上皮，干预组小鼠壁层胸膜AQP1水平较肿瘤组降低。结论 乙酰唑胺可以抑制胸膜肿瘤小鼠壁层胸膜AQP1及其mRNA的表达，减少恶性胸腔积液。
  【关键词】 恶性,胸膜肿瘤,乙酰唑胺,水通道蛋白1

  【Abstract】 Objective To investigate the effect of acetazolamide to AQP1 and malignant plural effusion in mice with malignant pleuroma. Methods Pleural tumor animal models are built and mice were assigned into pleuroma group（Group A）and intervention group（Group B）. Mice in Group B were fed with acetazolamide (40 mg·kg-1·d-1) daily. Plural effusion of mice in these two groups were compared. The levels of AQP1 and AQP1-mRNA were measured by immunohistochemistry and Real-Time PCR. Results The hemorrhagic effusion and tumor nodules in mice of group A and B, and the volume of MPE in group B decreased compared with that of group A, so did the expression of AQP1. Conclusion Acetazolamide can inhibit the generation of AQP1 and its mRNA′s expression and reduce the volume of malignant pleural effusion.
     【Key words】  Malignancy, Pleural tumor, Acetazolamide, Aquaporin 1
     【Author′s address】 Guangzhou first people′s hospital, Guangzhou, Guangdong, 510180, PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.11.011 

  近年来，呼吸系统肿瘤在全球范围内的罹患率上升很快［1-2］,这与居住环境及个人某些不良嗜好密切相关［3-5］，胸膜恶性肿瘤在其中所占的比例相对较低。但因其早期即累及胸膜，呼吸窘迫症状的发生早而迅速，患者很早即出现限制性通气障碍，生活质量极差，且其预后较差，因而，深入研究胸膜恶性肿瘤及恶性胸腔积液的发生、发展机制，有助于治疗疾病并改善患者生存质量。而在胸水的发生发展中，水通道蛋白起到很重要的作用［6-8］。肺部主要分布的水通道蛋白亚群为水通道蛋白 1(AQP1)，它与胸膜腔液体转运、肿瘤的发生、发展有一定的关系［9］。乙酰唑胺作为一个经典的药物，与AQP1与肺癌有着密切的关系，项阳及Ferlay J ［10-11］等证实，在肺癌组织内，AQP1的表达明显增强,应用乙酰唑胺可以部分抑制肺部肿瘤的发展，肿瘤转移抑制率达到83.9％。这一研究，使人们对乙酰唑胺这一经典药物有了新的认识，拓宽、加深了乙酰唑胺的可能使用范围，同时，也使人们从新的角度来重新认识、理解其药理作用机制。为进一步揭示在胸膜肿瘤的发生、发展过程中，乙酰唑胺与AQP1的变化。在本研究中，我们在肿瘤小鼠中使用乙酰唑胺，观察其壁层胸膜AQP1表达及恶性胸腔积液量的变化，希望能初步揭示三者之间的内在联系，期望从分子生物学角度为胸膜恶性肿瘤的治疗提供新思路和途径。
     1 研究分组及实验方法 
1.1 实验动物来源
     采用 C57BL／6J 品系小鼠，中山大学实验动物中心提供，鼠龄 6～8 w，质量20~25 g，性别随机，动物合格证号：SCXK［粤］2013-0124，动物批号：NO.0026037，实验前1 w进行环境适应性饲养；Lewis Lung Cancer 细胞（LLC 细胞）来自广州市第一人民医院中心实验室；乙酰唑胺片来自于燕京药业有限公司。
1.2 仪器与实验材料
     Eppendorf核酸-微量蛋白测定仪；ABI荧光定量 PCR 仪；Hettich低温离心机；远大科技免疫组化系统；辣根过氧化物酶标记的抗兔 Envision多聚物；电泳仪；Hyclone胎牛血清；Tissue-Tek全自动脱水机；DNA合成仪；兔抗鼠 AQP1多克隆抗体； 紫外分光光度计（日立公司）；Eppendorf PCR 仪；DAB试剂盒等。
1.3 小鼠分组
     肿瘤组（Group A）、乙酰唑胺干预组（Group B）及对照组（Group C），其中肿瘤组分为6、8、10 d三个亚组，每组7只，分别于注射肿瘤细胞6、8、10 d后处死；乙酰唑胺干预组同样分为1、8、10 d三个亚组，每组7只，注射肿瘤细胞的次日开始喂服乙酰唑胺（40 mg·kg-1·d-1，ig），胸膜腔内注入LLC细胞后，分别于6、8、10 d取标本；设立正常对照。 
1.4 建造动物模型
     复苏LLC细胞，进行培养，之后加入PBS将细胞浓度调至1×106。乙醚吸入麻醉小鼠，固定并暴露右胸壁，消毒后用注射器吸取细胞悬液005 mL，于小鼠右侧腋前线斜向上进针，对照组注入生理盐水。解剖发现白色肿瘤结节及血性胸水即为建模成功。 
1.5 收集标本
     将小鼠采用过量麻醉的方法处死，固定并剖开胸腔，观察胸膜腔肿瘤情况，记录胸水量。分离胸膜壁层，立即置于超低温冰箱及多聚甲醛液体。 
1.6 检测标本
1.6.1 检测胸膜壁层水通道蛋白1 壁层胸膜经甲醛固定、脱水后，按照免疫组化的操作规程直至修复抗原，按次序加入一抗、二抗，进行DAB显色，染色并封存，对照组的一抗使用PBS。水通道蛋白1阳性显色为亮棕色，表达水平与颜色深度呈正相关，图像分析使用免疫组化测量系统，最终得到的结果是蛋白平均灰度（D）。 
1.6.2 AQP1 mRNA表达 采用R-T PCR法，100 mg胸膜标本中放入Trizol 酶1 mL，彻底进行匀浆，Trizol法提取RNA，经水浴、低温离心、加异丙醇等过程，得到RNA标本。2 μL RNA样品，于500 μL DEPC 中稀释，于A(260)和A(280)处比色，RNA浓度＝A(260)×40 μg／mL×250＝10 μg/μL。采用 Primer express设计引物，序列如下：M-AQP1（92 bp）Forward Primer：5’-CTACACTGGCTGCGGTATCAAC-3’，Reverse Primer：5’-GCCCCACCCAGAAAATCC-3’；内参序列：M-GAPDH （73 bp） Forward Primer：5’-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3 Reverse Primer：5’-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3’。使用逆转录试剂盒（Invitrogen），引物为Oligo（dT）18,取 2 μg总RNA，加DEPC水至总体积12 μL。逆转录过程依照试剂盒操作指引进行，产物置于-20 ℃冰箱保存。委托达安基因公司合成引物，进行R-T PCR，50 μL反应体系中含 5×SYBR Green ⅠPCR Buffer 10 μL，上游引物 F 1 μL（浓度10 pmol／μL），下游引物R 1 μL（浓度10 pmol／μL），三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）1 μL，Taq 酶1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 35 μL。进行40个循环的扩增，条件：93 ℃、3 min，然后 93 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃、45 s，每个循环的第2个步骤收集荧光信号。10倍梯度稀释cDNA后进行 PCR 扩增检测扩增效率以样品拷贝数的对数为横坐标，Ct 值为纵坐标，最终计算结果为A值，按下列公式换算：A = B1（目的基因）÷B2（内参基因）。其中B=拷贝数/cDNA浓度。 
1.7 统计方法
     使用SPSS 110软件统计分析数据，计量资料用（±s）表示，组间比较采用t检验。检验水准α＝005。
2 结果 
2.1 各组胸腔大体情况
     正常对照组小鼠胸膜腔内壁呈粉红色，表面平滑，无胸水产生。肿瘤组及乙酰唑胺干预组解剖胸腔后，可于右侧胸膜腔见血性胸水，其中35例发现白色肿瘤结节（见图 1）。采集胸膜壁层制作石蜡切片，进行HE 染色，镜下可见胸膜内有肿瘤细胞浸润，癌细胞分布错乱（见图 2）；对照组未见肿瘤结节，内壁平滑。表1结果显示：随着胸膜肿瘤的发展，胸水量逐渐由6 d时的(040±002)mL增加至10 d时的(072±002)mL，在同一时间点，B组胸水量较A组减少（P＜005）。

 

表1 各组小鼠不同时间点胸水量比较

（±s，mL）

组别	n	6 d	8 d	10 d
A组	21(7×3)	0.40± 0.02	0.61±0.01	0.72±0.02
B组	21(7×3)	0.26±0.011)	0.39±0.041)	0.60±0.031)
C组	21(7×3)	0	0	0

 注：与肿瘤组比较，1)P＜0.05
2.2 各组壁层胸膜 AQP1水平
     壁层胸膜间皮细胞内见水通道蛋白1表达，肿瘤组平均灰度值较对照组升高。不同时间的对照组小鼠，AQP1平均灰度的差异无统计学意义（P＞0.05），肿瘤组小鼠 AQP1平均灰度值由6 d时的(0.47±0.01)升高至10 d时的(0.69±0.06)（P＜0.001），使用乙酰唑胺后，胸膜AQP1的灰度较同时间点的肿瘤组降低（P＜0.05）。见表2、图3。

表2 胸膜壁层水通道蛋白1水平比较

（±s）

组别	n	6 d	8 d	10 d
A组	21(7×3)	0.47±0.011)	0.53±0.031)	0.69±0.061)
B组	21(7×3)	0.35±0.022)	0.43±0.042)	0.60±0.012)
C组	21(7×3)	0.21± 0.03	0.24±0.02	0.23±0.05

 注：与正常对照组比较，1)P＜0.01；与肿瘤组比较， 2)P＜0.05

 

图3 A组小鼠胸膜免疫组化染色
2.3 AQP1mRNA表达
     胸膜恶性肿瘤组小鼠比对照组表达升高（P＜0.05），乙酰唑胺干预组小鼠 AQP1 mRNA表达较同一时间点的肿瘤组降低，差异有统计学意义 （P＜0.01）。见表3。

表3 各组壁层胸膜 AQP1 mRNA 表达比较

（±s）

组别	n	6 d	8 d	10 d
A组	21(7×3)	3.03±0.111)	4.72±0.241)	6.17±0.331)
B组	21(7×3)	2.17±0.032)	3.53±0.322)	5.19±0.612)
C组	21(7×3)	1.29±0.31	1.20±0.26	1.30±0.25

 注：与正常对照组比较，1)P＜0.05； 与肿瘤组比较，2)P＜0.01
3 讨论
     在呼吸系统肿瘤中，胸膜恶性肿瘤发生率相对较低，但预后极差，早期即可导致大量胸水的产生，严重影响患者的生存质量，因而，对其机制进行深入的研究、探讨极有必要。但因为其发生率较低，临床病例收集困难，因此，本研究采用了动物实验的方法，建立小鼠的胸膜肿瘤模型进行研究。 
     既往已有学者发现，肺部肿瘤发生后，受侵犯部位的通透性会增加，若累及到胸膜，会导致恶性胸腔积液的发生，这已被YANO S等［12］证实。虽然肿瘤组织水液通透性增加的具体机制尚未完全明了，但近年来的一些实验结果显示，水通道蛋白在肺部的水液转运中起重要作用［13］，已经有学者证实，AQP1与恶性胸腔积液及某些肿瘤关系较为密切［14-15］，一些研究者发现，通过抑制水通道蛋白的作用，可以减缓某些呼吸系统恶性肿瘤的发展［16］。因此，在本研究中，建立胸膜恶性肿瘤的模型后，使用乙酰唑胺抑制AQP1的作用，观察胸水量及AQP1的变化，最终发现：随着病情的进展，AQP1表达及胸水量进行性上升。而使用乙酰唑胺进行干预后， 胸水量、AQP1及其mRNA的水平明显降低。 
     通过这一研究，可以发现，使用乙酰唑胺可以抑制恶性胸腔积液的产生，降低胸膜肿瘤小鼠AQP1的表达水平，结合之前的研究结果可以推测：胸膜恶性肿瘤的发生、发展，与AQP1密切相关，而通过抑制AQP1的表达，有望减缓胸膜恶性肿瘤的进展。希望通过此次的基础研究，能更好地揭示胸膜恶性肿瘤发生发展的分子生物学机制，为将来的临床诊治奠定一定基础。

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