小鼠趋化因子受体7特异性shRNA腺病毒表达载体的构建和鉴定

基金项目：广东省医学科学技术研究基金(编号：A2015375)
何 伟 秦如斋 张小冬 刘文丹 潘春华：广州医科大学附属第四医院 广东广州 511447

小鼠趋化因子受体7特异性shRNA腺病毒表达载体的构建和鉴定

何 伟 秦如斋 张小冬 刘文丹 潘春华
CONSTRUCTION AND IDENDIFICATION OF MOUSE CC-CHEMOKINE RECEPTOR 7-SPECIFIC shRNA ADENOVIRAL EXPRESSION VECTOR
HE Wei, QIN Ruzhai, ZHANG Xiaodong, et al

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  【摘 要】 目的 构建小鼠CC趋化因子受体7(CCR7)基因特异性短发卡RNA（shRNA）真核表达载体，研究其对CCR7分子表达的影响。方法 根据小鼠CCR7 mRNA序列，设计三个shRNA序列，并插入表达载体pHBAd-U6-GFP中，经基因测序鉴定。然后用获得的重组CCR7 shRNA表达载体转染人胚肾细胞HEK293，进行病毒包装、出毒和扩增，测定病毒滴度TCID50，并用重组腺病毒感染小鼠MEF细胞，观察细胞绿色荧光强度，Western Blotting检测CCR7蛋白的表达。结果 基因测序证明：获得的三个shRNA载体序列与原设计序列完全相符，扩增后的病毒上清滴度分别为：1.0×1010 、1.6×1010和1.25×1010 PFU/mL。Ad CCR7 shRNA1腺病毒可明显下调小鼠MEF细胞CCR7蛋白表达。结论 成功构建了小鼠CCR7特异性shRNA腺病毒表达载体，并获得了高滴度病毒上清，为以后研究肿瘤淋巴转移的分子机制和信号通路打下了坚实的基础。
  【关键词】 小鼠CCR7受体,RNA干扰,腺病毒载体

  【Abstract】 Objective To construct eukaryotic expression vector encoding short hairpin RNA (shRNA) specific for the mouse cc-chemokine receptor 7 (CCR7) gene and research on its effect of the expression in CCR7 molecules.Method Three shRNA sequences, shRNA1, shRNA2 and shRNA3 based on the sequence of mouse CCR7 mRNA were designed and inserted into shRNA expression vector pHBAd-U6-GFP by gene sequencing. Then the recombinant CCR7 shRNA expression vectors, CCR7-shRNA1/2/3, and backbone vector pHBAd-BHG transfected human embryonic kidney cells, HEK 293, to process virus package, release and amplification and further examine and confirm the viral titer TCID50. At the same time, apply recombinant adenoviral to contaminatemouse MEF cell, observe cell′s green fluorescence intensity and detect the expression of CCR7 protein by Western Blotting. Result Proved by gene sequencing: The three shRNA vectors completely correspond to previous designed sequences and the amplified viral titers were respectively 1.0×1010 PFU/mL, 1.6×1010 PFU/mL and 1.25×1010 PFU/mL. CCR7 expression of mouse MEF cell protein was significantly down-regulated by Ad CCR7 shRNA1 adenoviral vector. Conclusion The shRNA adenoviral expression vector specific for mouse CCR7 was successfully constructed and high-titer viral supernatant obtained, which lays a solid foundation for further investigation of the molecular mechanism of tumor lymph metastasis and signal pathways. 
     【Key words】  Mouse cc-chemokine receptor 7, RNA Interference, Adenoviral vector
     【Author′s address】 The 4th affiliated hospital of guangzhou medical university, Guangzhou, Guangdong, 511447 PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.11.009 

  CCR7是一种G蛋白偶联受体，主要表达于未致敏和中央记忆淋巴细胞以及树突状细胞(Dendritic Cells, DC)表面，其配体为CC趋化因子配体21和19 (CC-chemokine Ligand 21/19, CCL21/ 19)，主要表达于次级淋巴器官(Secondary Lymph Organs,SLO)，包括淋巴结和派伊尔结(Peyer′s Patches)。CCR7的主要功能是通过与相应配体作用，趋化未致敏T淋巴细胞和定植于组织的活化DC细胞向SLO迁移，，使得加载抗原的DC细胞能够激活T细胞而启动免疫反应，因此是调控免疫反应的中心环节［1］。近年来发现，许多肿瘤细胞也可以表达CCR7，利用相似机制向淋巴结转移［2-4］，抗CCR7单克隆抗体可明显抑制肿瘤的生长和侵袭［5］。但是CCR7参与肿瘤进展和淋巴转移的分子机制和信号通路目前仍不清楚［6］。为此，我们构建了小鼠CCR7基因特异性shRNA表达载体，检测了其对细胞表面CCR7表达的抑制作用，为以后的进一步研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
     shRNA真核表达载体pHBAd-U6-GFP、人胚肾细胞系HEK293细胞、小鼠MEF细胞和LipofiterTM 转染试剂购自汉恒生物科技有限公司；大肠杆菌菌株DH5α是Invitrogen公司产品；限制性内切酶、T4DNA连接酶和DNA Ladder均购自Fermentas公司。质粒DNA大量抽提试剂盒是康为世纪生物科技有限公司产品；凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；DMEM 培养基、胎牛血清和胰酶购于Hyclone公司；滤膜滤器购自Millipore 公司。
1.2 实验方法
1.2.1 shRNA序列的设计和合成 根据GenBank小鼠CCR7基因已知序列，设计三条shRNA，分别称为：shRNA1、shRNA2和shRNA3，其编码的DNA序列如下：
     shRNA1靶序列：GTGCTTCAAGAAGGATGTGCG
     Top Strand(63bp)：5′aattcGTGCTTCAAGAAGGATGTGCGTTCAAGAGACGCACATCCTTCTTGAAGCACTTTTTTg-3′
     Bottom Strand(63bp)：5′gatccAAAAAAGTGCTTCAAGAAGGATGTGCGTCTCTTGAACGCACATCCTTCTTGAAGCACg-3′
     shRNA2靶序列：ACATTGCCTATGACGTCACCT
     Top Strand(63bp)：5′aattcACATTGCCTATGACGTCACCTTTCAAGAGAAGGTGACGTCATAGGCAATGTTTTTTTg-3′
     Bottom Strand(63bp)：5′gatccAAAAAAACATTGCCTATGACGTCACCTTCTCTTGAAAGGTGACGTCATAGGCAATGTg-3′
     shRNA3靶序列：ACGGATACCTACCTGCTCAAC
     Top Strand(64bp)：5′aattcACGGATACCTACCTGCTCAACTTCAAGAGAGTTGAGCAGGTAGGTATCCGTTTTTTTg-3′
     Bottom Strand(64bp)：5′gatccAAAAAAACGGATACCTACCTGCTCAACTCTCTTGAAGTTGAGCAGGTAGGTATCCGTg-3′
     引物由桑尼生物合成PAGE胶纯化的oligo序列，分别稀释至100 μmol/ L。
1.2.2 CCR7 shRNA的重组质粒载体的构建 ①载体的双酶切：pHBAd-U6-GFP质粒载体用BamHI，EcoRI双酶切，20 μL酶切体系为：4 μL载体(500 ng/μL)+1 μL BamHI+1 μL EcoRI+2 μL 10×buffer+12 μL H2O，37 ℃，1 h。酶切完成后常规胶回收。②单链目的基因片段退火连接：采用20 μL退火体系，包括：2 μL 10×Buffer、1 μL shDNA-R和1 μL shDNA-F、16 μL H2O。退火程序为：95 ℃，10 min→75 ℃，10 min→55 ℃，10 min→35 ℃ 10 min→15 ℃，10 min。退火产物用无菌双蒸水1∶ 100稀释待用。③稀释退火片段与线性化载体的连接：1 μL稀释好的退火产物，100~200 ng线性化载体，2 μL连接缓冲液，1 μL T4-DNA连接酶，充分混匀后用灭菌双蒸水补足20 μL，置于4 ℃过夜。④质粒载体的纯化和测序鉴定：各取5 μL过夜连接产物转化感受态细胞DH5α，分别涂于含有Amp抗性的LB平板上，37 ℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落，接种于3 mL含Amp抗性的LB培养液中，37 ℃ 250 r/min摇菌14 h，将菌液送桑尼生物技术有限公司测序。
1.2.3 重组腺病毒载体的包装、收毒、扩增及滴度测定 ①重组质粒的大量制备：将测序正确的对数生长期的菌液2 mL加入100 mL含100 μg/mL Amp的LB培养基中，37 ℃ 300 r/min震荡摇菌过夜，并提取质粒。②重组质粒的转染、包装及收毒：将293细胞接种于含有DMEM+10%胎牛血清的60 mm培养皿中,置37℃，5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至70%～80%汇合时，取重组载体质粒及骨架质粒，参考说明书用转染试剂进行转染，6 h后更换新鲜的细胞培养液，每天观察细胞出毒迹象，即细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将所有细胞及培养液收于15 mL离心管中，在液氮及37 ℃水浴反复冻融三次。3 000 r/min离心5 min，收集含病毒的上清液。该上清即为Ad-CCR7 shRNA第一代毒种(P1)，用于随后大量病毒的扩增。③第三代毒种的扩增、收毒及滴度测定：取2 mL P1代病毒上清感染一个10 cm细胞培养皿的细胞(细胞密度90%以上)。待所有细胞脱落，将细胞连同培养液一同收入15 mL离心管中，依前述方法冻融三次，取上清备用(P2代毒种)。每个75 cm2方瓶接种4×106个293细胞，共接种6个培养瓶，培养过夜，待细胞长满至90%时，将P2代病毒(除取少量－80 ℃保存外)全部接种培养瓶内，待细胞完全病变后，离心弃上清，加入6 mL培养液混匀，于-80 ℃和37 ℃冻融三次，离心取上清，作为第三代病毒(P3)。按文献记载的方法［7］，采用组织培养半数感染计量法(TCID50)测定重组腺病毒的滴度。病毒活性计算公式如下：对于100 μL样品，滴度T=101+d(s-0.5)，其中d=log10稀释度=1(对于10倍的稀释度而言);S=阳性比率之和(从第一个10倍稀释度算起)。将TCID50/mL转换成PFU/mL：T=a×10b TCID50/mL=a×10b-0.7 PFU/mL，两次重复实验得到的滴度值应相差≤100.7。
1.2.4 病毒感染小鼠MEF细胞及Western Blot检测 ①病毒感染小鼠MEF细胞:种植2×105个MEF细胞至6孔板中，待细胞生长至60%汇合后,分别感染Ad-GFP，AdCCR7shRNA1，AdCCR7shRNA2，AdCCR7shRNA3腺病毒，37 ℃ 5% CO2培养箱培养2 h后更换培养液，36 h后，荧光显微镜下观察GFP荧光的表达。②Western Blot检测CCR7蛋白表达：细胞用磷酸缓冲液洗3遍，刮取细胞，转移入EP管，置于冰上，加入500 μL RIPA完全裂解液，冰上裂解2 h，12 000 r/min×30 min，收上清。用BCA法测定样本蛋白含量，Western Blot检测目的蛋白表达情况。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
2 结果
2.1 重组质粒的测序鉴定
     测序结果表明：合成的双链DNA片段已成功插入pHBAd-U6-GFP干扰载体的BamHI和EcoRI位点之间，CCR7 shRNA1测序结果与原设计shRNA有一个碱基不符，经人工检查比对测序结果后，证实为测序峰图读码错误所引起；而CCR7 shRNA2和CCR7 shRNA3测得序列与原设计序列完全一致(图略)。
2.2 重组腺病毒TCID50的测定
     培养第10天在显微镜下观察每孔CPE情况，并与阴性对照对比，记录每排样品的阳性孔数，根据公式计算出AdCCR7 shRNA1、AdCCR7 shRNA2和AdCCR7 shRNA3的病毒滴度分别为1010.7 TCID50/mL、1010.9 TCID50/mL和1010.8 TCID50/mL，换算成PFU/mL分别为：1.0×1010 PFU/mL、1.6×1010 PFU/mL和1.25×1010 PFU/mL。
2.3 病毒感染小鼠MEF细胞
     细胞培养36 h后，荧光倒置显微镜下观察，成功转染重组质粒载体的细胞均可见报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达(见图1)。

注:细胞转染36 h后，在荧光倒置显微镜下观察，转染重组质粒载体的细胞可见GFP的绿色荧光信号。A：空载体Ad-GFP对照；B：转染重组质粒载体Ad-CCR7 shRNA1的细胞；C：转染重组质粒载体Ad-CCR7 shRNA2的细胞；D：转染重组质粒载体Ad-CCR7 shRNA3的细胞；放大倍数：10×10

图1 转染重组质粒载体的小鼠MEF细胞表达GFP
2.4 Western Blot检测小鼠MEF细胞CCR7蛋白的表达
     如图2上半部分所示，36 h后，同对照细胞(NC)相比，sh1组的细胞CCR7蛋白表达明显减少，sh2组的蛋白表达有所下降，而sh3组的细胞CCR7蛋白的表达无明显变化。采用Quantity One图像分析软件测得的CCR7蛋白的相对表达水平(见图2下半部分)分别为：NC 0.638；shRNA1 0.118；shRNA2 0.276；shRNA3 0.563，即与对照相比，三种重组质粒转染的细胞CCR7蛋白表达水平分别下降81.5%、56.7%和11.8%。上述结果证明，AdCCR7-shRNA1腺病毒构建成功，CCR7下调效率最明显。
3 讨论
     远处转移是恶性肿瘤的主要生物学特征之一，也是大多数恶性实体瘤的首要致死原因。肿瘤的远处转移是多种因子参与的复杂过程，是非随机和器官特异性的。研究提示：趋化因子及其受体在转移发生和发展过程中起着十分关键的作用［8］。许多肿瘤细胞可高表达CCR7［8］，通过与SLO基质细胞相应配体的趋化作用而选择性地向淋巴结转移。肿瘤组织的CCR7表达明显高于相应正常组织或者癌旁组织，并且与患者的TNM分期、淋巴结转移等密切相关［9］。最近的研究还发现，CCR7-CCL21相互作用还可促进淋巴管生成，有利于局部转移灶的形成［10］，拮抗CCR7的趋化作用则

注：上半部分：蛋白印迹图；下半部分：蛋白质的相对表达水平。NC：对照组；sh1：转染AdCCR7-shRNA1的细胞组；sh2：转染AdCCR7-shRNA2的细胞组；sh3：转染AdCCR7-shRNA3的细胞组；GAPDH：内参照
 图2 Western Blot检测转染重组质粒载体的小鼠
MEF细胞表达CCR7蛋白
可明显抑制肿瘤细胞的侵袭和转移［5］。目前尚不清楚CCR7促进恶性肿瘤淋巴结转移的详细分子机制，有研究发现：CCR7可激活整合素αvβ3，通过促进肿瘤细胞与细胞外基质的粘附而发生转移［11］。CCR7亦可通过PI3K/ Akt/ mTOR等信号通路激活NF-κB而增强癌细胞的存活［12］。在乳腺癌细胞中，CCR7可以激活AKT信号通路，促进VEGF-C的分泌，增强淋巴管生成［10］，而拮抗VEGF-C的作用则可以抑制肿瘤细胞的粘附和侵袭能力［13］。另外，最近还发现，趋化因子与肿瘤耐药有关，抑制趋化因子信号可明显增强肿瘤细胞对铂剂的敏感性［14-15］。综上所述，CCR7参与了恶性肿瘤细胞的淋巴结转移和耐药，但其机制尚不清楚。有鉴于此，我们构建了小鼠CCR7基因特异性shRNA腺病毒表达载体，采用RNA干扰技术进一步深入研究肿瘤组织表达CCR7与淋巴结转移的关系,并试图深入探讨其分子机制和信号通路。
     RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象［16］。RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，用于分析哺乳动物细胞的目的基因功能及肿瘤相关基因功能的确定。目前已经开发出能够稳定转染哺乳动物细胞并持续表达shRNA的真核表达载体，表达的shRNA能够在体内被加工成为小干扰RNA(siRNA)而发挥特异性基因沉默作用［17］。与使用单克隆抗体［18］或小分子抑制物［19］ 来拮抗趋化因子受体/配体间的相互作用相比，siRNA干扰技术具有拮抗作用更彻底，持续时间更长久的优点。
     综上所述，本实验成功构建了三个小鼠CCR7基因特异性重组腺病毒表达载体，分别称为AdCCR7-shRNA1、AdCCR7-shRNA2和AdCCR7-shRNA3，并筛选出敲除效应最高的表达载体AdCCR7-shRNA1，获得了大量的可用于感染靶细胞的高滴度病毒上清，为将来进一步研究CCR7表达参与恶性肿瘤淋巴道转移、淋巴管生成和耐药性形成分子机制和信号通路打下了坚实的基础。

(下转第32页)(上接第28页)

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