广东清远地区地中海贫血基因型分布调查

基金项目：广东省医学科研基金（编号：A2014837）；广东省自然科学基金（编号：2014A030307047）
黄振勇 刘艳枚 刘 倩 叶韵婕 潘敏燕：暨南大学医学院第五附属医院/清远市人民医院 广东清远 511518

广东清远地区地中海贫血基因型分布调查


黄振勇 刘艳枚 刘 倩 叶韵婕 潘敏燕
THE INVESTIGATION OF THALASSEMIA GENOTYPES IN QINGYUAN DISTRICT GUANGDONG PROVINCE
HUANG Zhenyong, LIU Yanmei, LIU Qian, et al

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  【摘 要】 目的 了解广东清远地区α与β地中海贫血基因类型及其分布情况。方法 采用应用跨越断裂点PCR扩增法（Gap-PCR）及膜反向杂交技术对4 194例受检者进行α与β地中海贫血基因检测。结果 在4 194例受检标本中，确诊为地贫基因携带为2 254例，其中缺失型α地贫1 386例，β地贫784例，α复合β地贫84例。结论 本研究获得清远地区的地贫基因类型及其分布频率的资料，可为本地区制定地贫防控策略提供参考。
  【关键词】 地中海贫血,基因型,分布频率

  【Abstract】 Objective To investigate the genotype and frequency distributions of α- and β-thalassemia in Qingyuan region, Guangdong province. Methods Gap-PCR and reverse dot blot (RBD) were utilized to analyze the α- and β-thalassemia genotypes in 4194 samples．Results In the 4 194 samples, 2 254 samples were confirmed as thalassemia gene carriers. 1386 cases carry α-thalassemia gene; 784 cases carry β-thalassemia gene, and 84 cases carry both αand β-thalassemia genes. Conclusion This study shows the genotype and frequency distribution of thalassemia in Qingyuan region, and it will offer the guidance for prevention strategies against the thalassemia in this region.
     【Key words】  Thalassemia, Genotype, Frequency distribution
     【Author′s address】 The Fifth Affiliated Hospital of Medical College Jinan University, Qingyuan city People's Hospital, Qingyuan, Guangdong, 511518, PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.08.011

  地中海贫血（Thalassemia,地贫）是全球最常见的常染色体遗传病之一，在中国主要分布在南方地区，尤以两广地区为甚。目前地贫尚无理想的治疗手段，由于造血干细胞移植费用高昂，配型困难，重症地贫患者多依赖长期的输血联合除铁治疗来维持生命。因此，通过婚前、孕前、产前的筛查与诊断，防止重型地贫患儿的出生，是现阶段进行地贫人群防控最有效的措施［1］。清远地区位处广东西北部，与广西接壤，是地贫的高发区域，现将我们所得数据进行总结归纳，为地贫的防控提供参考。
     1 材料与方法
1.1 标本来源
     2008年1月~2014年12月清远市人民医院门诊及住院进行地贫基因检测的受检者4 194例，年龄3个月~75岁，其中住院331人，门诊3 863人; 男1 362例，女2 832例。采用枸橼酸钠9∶ 1抗凝真空管抽取受检者静脉血2 ml。检测后剩余标本-80 ℃冷冻保存。
1.2 研究方法
1.2.1 DNA制备 采用基因组DNA快速提取试剂盒(深圳益生堂生物企业有限公司提供)进行样品 DNA的提取。
1.2.2 缺失型α地贫基因诊断 应用跨越断裂点PCR扩增法（Gap-PCR）进行东南亚缺失--SEA、右缺失-α3.7和左缺失-α4.2三种我国常见的缺失型基因检测。取DNA 4μl加入反应管，PCR扩增条件为95 ℃10 min，(98 ℃ 45 s,66 ℃ 30 s,72 ℃ 180 s,35个循环)，72 ℃ 7 min。扩增后取产物6 μl加于1.2%琼脂糖凝胶中，8 V/cm电压下电泳40 min，于核酸凝胶分析系统中观察与判断结果。
1.2.3 β地贫基因诊断 应用膜反向杂交技术检测中国人群常见的41-42M、654M、17M、-28M、-29M、43M、71-72M、31M、βEM、27-28M、14-15M、-30M、-32M、CAP、IVS1-1M、IVS1-5M、IntM等17种突变。取DNA 4 μl加入反应管，PCR扩增条件为94 ℃ 5 min，(94 ℃ 60 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,35个循环)，72 ℃ 5 min。扩增后将产物与已标记探针的膜条进行杂交与显色，可肉眼观察与判断结果。α地贫与β地贫检测试剂均由益生堂生物企业有限公司提供，实验操作严格按说明书进行。
1.3 统计学处理
     用Microsoft Excel软件建立数据库并进行相关分析和处理。
     2 结果
     在4 194例受检标本中，确诊为地贫基因携带为2 254例，其中缺失型α地贫1 386例，β地贫784例，α复合β地贫84例。
2.1 缺失型α地贫基因类型分析 
     在1 386例缺失型α地贫与84例α复合β地贫中，共有8种α地贫基因型，最常见类型为东南亚型（--SEA/αα）1 181例，占80.34%；其次为右缺失型（-α3.7/αα）165例，占1122%；再次为左缺失型（-α4.2/αα）65例，占4.42%。具体的α地贫基因型别与构成比例见表1。

表1 缺失型α地贫基因类型及其比例

 

基因型	例数/n	比例/%
—SEA/αα	1181	80.34
-α3.7/αα	165	11.22
-α4.2/αα	65	4.42
-α3.7/--SEA	39	2.65
-α4.2/--SEA	14	0.95
-α3.7/-α3.7	3	0.21
-α4.2/-α4.2	2	0.14
-α3.7/-α4.2	1	0.07
合计	1 470	100.00

2.2 β地贫基因类型分析
     在784例β地贫与84例α复合β地贫中，检测范围内的17种突变有13种被检出，基因型有25种；其中杂合子13种838例，双重杂合子10种25例，纯合子2种5例。占比最高的五种β地贫突变为41~42M、654M、-28M、17M、βEM。具体的β地贫基因型别与构成比例见表2。

表2 β地贫基因类型及其比例

 

基因型	例数/n	比例/%
41-42M/N	385	44.35
654M/N	201	23.16
-28M/N	88	10.14
17M/N	88	10.14
βEM/N	20	2.30
43M/N	18	2.07
71-72M/N	17	1.96
-29M/N	8	0.92
27-28M/N	6	0.69
14-15M/N	4	0.46
CAP/N	1	0.12
IVS1-1M/N	1	0.12
IVS1-5M/N	1	0.12
654M/41-42M	6	0.69
-28M/41-42M	5	0.58
17M/41-42M	4	0.46
41-42M/ 41-42M	4	0.46
-28M/-29M	2	0.23
41-42M/βEM	2	0.23
654M/-29M	2	0.23
17M/17M	1	0.12
-28M/βEM	1	0.12
654M/βEM	1	0.12
41-42M/ IVS1-1M	1	0.12
41-42M/ IVS1-5M	1	0.12
合计	868	100.00

2.3 α复合β地贫基因类型及其比例
     84例α复合β地贫中，共有17种基因型组合，其中41-42M/N + --SEA/αα为23例（27.38%）和654M/N+ --SEA/αα为17例（20.24%）最常见。α复合β地贫具体型别与构成比例见表3。

表3 α复合β地贫基因类型及其比例

 

基因型	例数/n	比例/%
41-42M/N + --SEA/αα	23	27.38
654M/N+ --SEA/αα	17	20.24
-28M/N+ --SEA/αα	8	9.52
41-42M/N+ -α3.7/αα	7	8.33
654M/N+ -α3.7/αα	5	5.95
41-42M/N+ -α3.7 /--SEA	4	4.76
17M/N+ --SEA/αα	4	4.76
17M/N+ -α4.2/αα	3	3.57
17M/N+ -α3.7/αα	3	3.57
654M/N+ -α4.2/αα	2	2.38
41-42M/N+ -α4.2/αα	2	2.38
βEM/N+ --SEA/αα	1	1.19
43M/N+ -α3.7/αα	1	1.19
43M/N + --SEA/αα	1	1.19
41-42M/N+ -α3.7/ -α3.7	1	1.19
41-42M/IVS1-1M+ -α3.7/αα	1	1.19
17M/17M+ -α3.7/αα	1	1.19
合计	84	100.00

3 讨论
     本研究检测到8种α地贫基因型，其中比例最大的为标准型--SEA/αα，占80.34%，低于邻近同属广东地区的梅州88.64%［2］，略高于河源78.8%［3］，远高于四会53.4%［4］。估计这个差异形成与地域因素有关，清远地处广东西北，北部为山区，南部与珠三角交接，形成一个半闭塞与半开放的环境，加上经济欠发达，原住民居多，外来人口相对较少，这点与梅州、河源类似。另外Hb H病基因型（-α3.7/--SEA，-α4.2/--SEA）检出53例，比例为3.70%。Hb H病患者通常中度贫血，虽为一个非致死性疾病，但患者的重体力活动，如体育运动等均受限，严重地影响了患者的生活质量。如果夫妻双方均为标准型--SEA/αα，或一方为标准型--SEA/αα而另一方为静止型，都有四分之一的可能性生育Bart’s水肿胎或Hb H病，这将给其家庭带来沉重的心理负担。因此，做好本地区的α地贫防控，应加大对人群的普查与筛查，普及地贫的相关防治知识，加强产前咨询与产前诊断工作，防止重型α地贫与Hb H病患儿的出生。
     本研究显示，本地区最常见的β地贫突变位点为41-42M、654M、-28M和17M，四者出现频率合共91.24%（含纯合子与双重杂合子），其中以41-42M突变最高，为47.00%。这与广东其他地区的分布基本一致，但与梅州的654M突变比例最高（40.5%）有所不同，这可能与梅州地区以客家人群为主有关［2］。本研究检出双重杂合子25例，纯合子5例。通常这些病例在出生几个月后开始发病，一般表现为中到重度贫血，需输血与除铁治疗维持生存，严重者在未成年时夭折，造血干细胞移植为目前唯一有效的治疗方式［5］。重型地贫患者的治疗给其家庭带来沉重的经济负担与心理压力。若夫妻双方均为β地贫突变基因携带者，就有四分之一的几率生育一个重型β地贫患儿。做好产前筛查与诊断，对诊断为β地贫双重杂合子或纯合子的胎儿建议其及时引产，避免重症地贫患儿的出生，是减轻家庭与社会经济和精神负担，提高人口素质的有效措施。

(下转第31页)(上接第28页)
84例α复合β地贫病例中，α缺失型基因的出现频率依次为--SEA、-α3.7与-α4.2；出现的β地贫突变位点有6种，多见的依次为41-42M、654M、17M、-28M、43M、βEM和IVS1-1M，分别为38、24、11、8、2、1和1次。这些病例中地贫基因出现的频率基本与本地区常见的α、β地贫基因型分布基本一致。α复合β地贫携带者无论与单纯型的α或β地贫携带者，或者与同样的α复合β地贫携带者婚配，其后代携带地贫基因甚至是重型地贫（水肿胎或重型β地贫）的风险都比单纯型的为高。但由于α复合β地贫的病例在血红蛋白电泳筛查中常表现为β地贫特征，即HbA2升高，HbF正常或升高，从而判断为β地贫［6］。因此重视α复合β地贫的检测，对筛查为β地贫者同时进行β与α地贫的基因检测，不仅可以降低漏诊和误诊率，也为地贫产前诊断和防止重型地贫儿的出生提供重大的指导意义。
     清远地区位于广东西北部，经济相对落后，群众对地贫及其危害性了解不足。政府职能部门与各级医疗机构应联合协作，加强相关知识的宣传与普及，对各级卫生医疗机构的相关医务人员进行地贫知识的培训，引导广大群众参与婚前、孕前检查，预防重症地贫患儿的出生，提高人口素质。本研究获得清远地区的地贫基因类型及其分布频率的资料，可为本地区制定地贫防控策略提供参考。

参考文献
［1］ KALOKAIRINOU E M.The experience of β-thalassaemia and its prevention in Cyprus ［J］.Medlaw,2008,27(4):825-841.
［2］ 黄烁丹,张惠琴,邹 婕,等.广东省梅州地区地中海贫血的分子流行病学调查［J］.热带医学,2011,11(7):788-790.
［3］ 刘平,刘天明.河源地区地中海贫血筛查及基因分析［J］.中国优生与遗传杂志,2012,20(7):38-40.
［4］ 谭金荣,李文军,马建英,等.四会市α和β地中海贫血的分子流行病学调查［J］.第一军医大学学报,2003,23(7):716-719.
［5］ DI BARTOLOMEO P,SANTARONE S,DI BARTOLOMEO E,et al.Long-term results of survival in patients with thalassemia major treated with bone marrow transplantation［J］.Am J Hematol,2008,83(7):528-530.
［6］ 黄道连,袁春雷,冯丹艺.αβ复合型地中海贫血筛查结果分析［J］.中国小儿血液与肿瘤杂志,2011,16(5):214-216.