中国结核分枝杆菌株rpoB基因耐药决定区外序列的基因突变

基金项目：广东省科技计划项目(编号：2011B318800377)；广东省科技计划项目(编号：2013B021800060)
李 丽：广东省茂名农垦医院 广东茂名 525200
孟繁荣 刘志辉：广州市胸科医院  广东广州 510095
通讯作者：刘志辉

中国结核分枝杆菌株rpoB基因耐药决定区外序列的基因突变

李 丽 孟繁荣 刘志辉
MUTATIONS OUTSIDE THE RIFAMPICIN RESISTANCE-DETERMINING REGION ASSOCIATED WITH RIFAMPICIN RESISTANCE OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS IN PRC
LI Li, MENG Fanrong, LIU Zhihui

---

  【摘 要】 目的 了解中国结核分枝杆菌（MTB）rpoB基因耐药决定区外序列突变与利福平耐药表型间的关系，为全面、深刻MTB利福平耐药的分子机制及其分子诊断方法的完善和优化提供科学依据。方法 对在PubMed数据库中检索到的7项有关MTB rpoB基因耐药决定区外序列突变与利福平耐药表型间关系的研究进行数据提取和分析，合并计算基因突变率。结果 7项研究共对1 195株MTB（包括263株敏感株和932株耐药株）rpoB基因耐药决定区（RRDR）外序列的DNA测序结果进行了分析。在1株敏感菌中检测到657位点的P/P同义突变（CCC/CCT）；在115株（12.34%）耐药菌中检测到86种类型的突变，其中：21株的16种类型的突变独立发生于RRDR外序列的146、176、206、314、323、505、572、626、657、891单位点与146/402、311/060、311/112双位点及139/201/167三位点，占RRDR外序列突变的18.26%(21/115)，总发生率为2.25%（21/932）；其余94株的70种类型的突变则与RRDR序列突变共同发生，多为双位点突变（87株），占RRDR外序列突变的81.74%(94/115)，总发生率为10.09%（94/932）。结论 MTB耐药株中rpoB基因耐药决定区（RRDR）外序列的基因突变并非少见，应予关注；但独立突变发生率较低，对目前各种利福平耐药分子诊断方法的性能影响不大。
  【关键词】 结核分枝杆菌,rpoB基因,基因突变,循证分析,,
     doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.08.010

  结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis，MTB）利福平（Rifampicin，RFP）耐药主要由MTB rpoB基因突变所致目前已为共识［1］。rpoB基因含3534bp的开放阅读框，编码1 178个氨基酸（AA），但众多实验研究证实［2-3］其突变主要发生在507~533位的81个碱基区域内，人们称之为利福平耐药决定区（Rifampin Resistance-Determining Region，RRDR）序列，我们对包含4 149 株中国RFP耐药MTB株的54项研究的循证分析则获得了更为充分的证据（另文发表）。但是也有学者呼吁RRDR外序列的突变在MTB对RFP耐药中的作用不可小视［4-5］，在前述的循证分析中我们也发现一些研究也涉及RRDR外序列的突变，现报告如下。
     1 资料与方法
1．1  检索数据库 计算机检索PubMed数据库关于RFP耐药MTB 与rpoB基因突变相关的研究文献，末期检索日期为2015年3月31日。
1．2 文献检索策略 以“Mycobacterium tuberculosis”、“rpoB”、“China”、“Hong Kong ”、“Macon”和“Taiwan”为关键词，采用“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND China”、“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Hong Kong”、“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Macon”和“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Taiwan”检索式进行检索。
1．3 文献纳入和排除标准 纳入标准：①研究MTB菌株自中国34省、市、自治区和特别行政区；②MTB利福平耐药表型分析方法可靠、菌株耐药表型鉴定明确；③采用DNA测序法进行基因序列分析；④分析序列包括RRDR外的完整rpoB基因序列；⑤提供基因突变位点和氨基酸变化等详尽信息。排除标准：①重复报道文献；②二次研究文献；③突变位点、氨基酸变化等相关信息不全的研究；④中文、英文以外语种文献。
1．4 文献筛选和数据提取 分为浏览文题与摘要初筛、获取文献全文并仔细研读分析确定纳入文献、纳入研究的数据提取与分析三个阶段。对Pubmed数据库中非免费全文文献借助广东省科技图书馆原文传递系统公共平台获得；文献筛选、数据提取和分析由2名专业人员（本文第一、二作者）严格按照纳入和排除标准独立进行，通过浏览文题与摘要去除不合格文献；通过研读全文确定纳入研究并提取和分析相关数据，内容包括：第一作者姓名、研究机构、Pubmed标识码PMID、文献发表年度、菌株来源、研究菌株总数以及突变类型、位点、碱基变化、氨基酸（AA）变化、突变株数量（N）等；对于分析过程中的分歧与纳入研究的审定由第三位研究者（本文通讯作者）裁定。
1．5 统计学分析 对纳入研究文献的基因突变计数资料信息（如菌株数量、构成比%）等进行合并计算。
     2 结果
2．1 文献检索结果
     应用4个检索式共检索到MTB 耐多药、RFP耐药与其相应耐药基因测的的相关研究文献130篇，经浏览文题与摘要后，筛选出99篇文献进行全文分析；在全文分析过程中分析人员未出现观点分歧，最终7篇文献纳入研究（包括中文文献2篇、英文文献5篇）。7项研究的MTB菌株包括263株RFP敏感株和932株RFP耐药株，纳入研究的基本情况见表1。

表1 纳入研究的基本情况

(n)

纳入研究	菌株来源	样本量
		RFP敏感株	RFP耐药株
刘敬华,张丽水,刘志广,等.中华流行病学杂志,2006,27(11).	福建	37	47
李苗,司红艳,郭璐,等.中华结核和呼吸杂志, 2010,33(2).	甘肃	2	17
Tan Y, Hu Z, Zhao Y,et al.J Clin Microbiol. 2012,50(1).	广东、广西、湖南、江西、海南	30	362
Yuan X, Zhang T, Kawakami K,et al.J Clin Microbiol. 2012,50(7).	江西	20	77
Tang K, Sun H, Zhao Y,et al.Tuberculosis(Edinb). 2013,93(1).	四川	55	214
Zhao LL, Chen Y, Liu HC,et al.Antimicrob Agents Chemother.  2014,58(4).	福建、贵州、广西、山西、上海、西藏	0	128
Guo Q, Yu Y, Zhu YL,et al.Biomed Environ Sci. 2015,28(1).	西藏、湖南、新疆、河南、四川、安徽	119	87

2．2 263株RFP敏感MTB株RRDR外序列分析结果
     在1株敏感菌中检测到657位点的第三碱基由C突变为T（CCC/CCT），但编码氨基酸种类（P）未发生变化，系P/P同义突变。
2．3 932株RFP耐药MTB株RRDR外序列分析结果
     在115株耐药菌中检测到86种类型的突变，占12.34%。其中：21株的16种类型的突变独立发生于RRDR外序列的146、176、206、314、323、505、572、626、657、891单位点与146/402、311/060、311/112双位点及139/201/167三位点，占RRDR外序列突变的18.26%(21/115)，总发生率为2.25%（21/932）；其余94株的70种类型的突变则与RRDR序列突变共同发生，多为双位点突变（87株），占RRDR外序列突变的81.74%(94/115)，总发生率为10.09%（94/932）。具体突变情况见表2。

表2 932株利福平耐药中国MTB株rpoB基因非RRDR序列基因突变情况

 

突变位点	AA变化	n	%	突变位点	AA变化	n	%	突变位点	AA变化	n	%
146	V/F	4	0.43	491,526	T/Q,H/D	1	0.11	531,272	S/L，K/E	1	0.11
176	V/F	2	0.21	511,572	L/P，I/M	1	0.11	531,335	S/L，S/P	1	0.11
206	P/R	1	0.11	511,572	L/P,I/F	1	0.11	531,367	S/L，A/V	1	0.11
314	Y/C	2	0.21	511,574	L/P，S/L	3	0.32	531,386	S/L，V/L	2	0.21
323	H/Y	1	0.11	511,574	L/P,S/F	3	0.32	531,480	S/L，T/I	1	0.11
505	F/F	1	0.11	513,247	Q/L，E/G	1	0.11	531,481	S/L，T/A	2	0.21
572	I/F	1	0.11	513,561	Q/E,I/V	1	0.11	531,561	S/L，I/T	2	0.21
572	I/T	1	0.11	513,564	Q/P,P/S	1	0.11	531,569	S/L,I/V	1	0.11
626	D/E	1	0.11	513,574	Q/K,S/P	1	0.11	531,572	S/L，I/V	4	0.43
657	P/H	1	0.11	513,633	Q/P,R/L	1	0.11	531,577	S/L，V/G	1	0.11
657	P/P	1	0.11	513,880	Q/K，Q/K	1	0.11	531,584	S/L,F/S	4	0.43
891	K/T	1	0.11	513,916	Q/K，H/R	1	0.11	531,603	S/L,I/M	2	0.21
144,526	V/G,H/N	1	0.11	516,253	D/Y，Q/R	1	0.11	531,615	S/L,V/M	1	0.11
146,402	V/F,P/S	1	0.11	516,541	Q缺失，E/G	1	0.11	531,621	S/L，S/A	1	0.11
149,516	L/P,D/G	1	0.11	516,572	D/G,I/L	1	0.11	531,626	S/L，D/E	1	0.11
195,531	R/G,S/L	1	0.11	516,572	D/Y，I/M	2	0.21	531,643	S/L，V/M	1	0.11
261,251	H/D，D/V	1	0.11	516,572	D/E，I/T	1	0.11	531,652	S/L，D/G	1	0.11
311,060	S/L，L/R	1	0.11	516,572	D/Y,I/L	1	0.11	531,655	S/L，D/E	1	0.11
311,112	S/L，V/A	1	0.11	526,459	H/Y，L/R	1	0.11	533,346	L/P，D/G	2	0.21
381,531	A/V,S/L	1	0.11	526,541	H/Y，E/G	4	0.43	533,562	L/P，E/A	2	0.21
457,531	G/V,S/L	1	0.11	526,572	H/S,I/L	1	0.11	139,201,167	Q/K，G/C，K/R	1	0.11
459,526	L/R,H/Y	1	0.11	526,572	H/N,I/L	1	0.11	490,516,526	Q/H,D/Y,H/D	1	0.11
472,526	D/G,H/Y	1	0.11	526,574	H/N,S/T	1	0.11	511,572,643	L/P,I/L,E/G	1	0.11
472,531	E/Q,S/L	1	0.11	526,626	H/R,D/E	1	0.11	515,526,535	M/V,H/H,P/S	1	0.11
481,526	T/T,H/Y	2	0.21	526,952	H/R，R/H	1	0.11	526,511,420	H/Q，L/P，L/V	1	0.11
481,531	T/T,S/L	1	0.11	531,103	S/L，S/L	1	0.11	531,345,955	S/W，S/P，S/Y	1	0.11
481,531	T/A,S/L	2	0.21	531,111	S/L，P/S	1	0.11	531,615,626	S/L,V/M,D/E	1	0.11
490,531	Q/H,S/L	1	0.11	531,126	S/L，P/A	1	0.11	490-491/415-416	H/N,P/L	1	0.11
491,526	T/R,H/R	1	0.11	531,126	S/L，P/S	3	0.32	插入C，526，535

3 讨论
     结核病作为一种古老的疾病，目前仍为全球的重大公共卫生问题，耐药尤其是耐多药结核病的出现与蔓延，人们面临着更为严峻的考验。所谓耐多药结核病，即其感染MTB株至少对RFP和异烟肼耐药。在结核病化疗中，RFP作为一种全杀菌药，可明显缩短治疗疗程，MTB对RFP耐药则意味着需要延长疗程，对于合并其它抗结核药物耐用药者则有可能成为不治之症，耐多药结核病患者即属此列。人们早已认识到：RFP主要通过和MTB中DNA依赖的RNA聚合酶的结合抑制转录过程而导致细菌细胞死亡，MTB对RFP耐药即有约90%以上的可能为耐多药结核病［6］，而约95%的RFP耐药MTB 存在rpoB基因突变［7］。正是由于rpoB基因突变在诊断耐多药结核病中的特殊地位，人们创建了诸如PCR线性控针技术［8］ 、DNA芯片技术［9］等多种在利福平耐药分子检测方法。这些方法主要针对rpoB基因RRDR序列，本文的分析结果显示虽有12.34%的RFP耐药MTB株会产生RRDR外序列的突变，但所幸的是它们多与RRDR序列突变共同发生，其独立发生的频率只占2.25%，不会太大影响这些检测方法的总体性能。
     虽然如此，但已有证据证明RRDR外序列突变可能参与了利福类抗结核药物交叉耐药的形成，rpoB基因序列中的V176F、P206R、Y314C、H323Y基因突变可能和RFP与利福布汀的交叉耐药有关［5］。我们的前期相关分析也提示RFP耐药MTB其rpoB基因不产生突变的频率与其耐其它抗结核药物的情况密切相关［10］。因此，我们推测：在MTB对多种抗结核药物的耐药中，RRDR外序列突变可能以目前人们尚未认知的方式在起作用，不能因为低的RRDR外序列独立突变发生率而忽视对其应有的研究。
     至于RFP耐药MTB株RRDR外序列突变的分子特征目前人们所知相对有限，有研究显示 146和572位点突变与RFP耐药［11］有关，146位点突变则极有可能与低浓度耐药关系密切［12］。本文通过循证分析获得了中国MTB株RRDR外序列146、176、206、314、323、505、572、626、657、891单位点与146/402、311/060、311/112双位点及139/201/167三位点等86种突变类型，集成和丰富了RFP耐药MTB株RRDR外序列突变的分子特征信息，对以后的相关研究应具借鉴意义。
     毋须讳言，本文所纳研究不多，从地域代表性方面看菌株来源也相对有限，难能代表中国MTB株总体。因此，本文所获得的RFP耐药MTB株RRDR外序列突变信息自然也不能描述为中国RFP耐药MTB株rpoB基因RRDR外序列突变的分子特征。但我们相信本文的分析结果能起到抛砖引玉的作用，若能如此，也就达到我们的初衷了。当然，我们也会加倍努力多进行此方面的实验研究工作。

参考文献
［1］ GOLDSTEIN B P. Resistance to rifampicin: a review ［J］. J Antibiot(Tokyo), 2014,67(9):625-630.
［2］ AHMAD S, MOKADDAS E, FARES E. Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Kuwait and Dubai ［J］. Diagn Microbiol Infect Dis, 2002,44(3):245-252.
［3］ CHEN L, GAN X, LI N,et al. rpoB gene mutation profile in rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Guizhou, one of the highest incidence rate regions in China［J］. J Antimicrob Chemother, 2010,65(6):1299-1301.
［4］ SIU G K, ZHANG Y, LAU T C, et al. Mutations outside the rifampicin resistance-determining region associated with rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］. J Antimicrob Chemother, 2011,66(4):730-733.
［5］ TAN Y, HU Z, ZHAO Y, et al. The beginning of the rpoB gene in addition to the rifampin resistance determination region might be needed for identifying rifampin/rifabutin cross-resistance in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Southern China［J］. J Clin Microbiol, 2012,50(1):81-85.
［6］ ESPINAL MA, DYE C, RAVIGLIONE M, et al. Rational 'DOTS plus' for the control of MDR-TB［J］. Int J Tuberc Lung Dis, 1999,3(7):561-563.
［7］ 吴雪琼,张宗德,乐军.分枝杆菌分子生物学［M］.北京:人民军医出版社,2010:125-139.
［8］ HILLEMANN D, R?SCH-GERDES S, RICHTER E. Evaluation of the GenoType MTBDRplus assay for rifampin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens［J］. J Clin Microbiol, 2007,45(8):2635-2640.
［9］ GUO Y, ZHOU Y, WANG C, et al. Rapid, accurate determination of multidrug resistance in M. tuberculosis isolates and sputum using a biochip system［J］. Int J Tuberc Lung Dis, 2009,13(7):914-920.
［10］ 卓文基,刘志辉,钱明,等.一线抗菌素结核药物不同耐药表型的利福平耐药结核杆菌rpoB基因突变分析［J］.现代医院,2014,14(4):4-6.
［11］ SIU G K, ZHANG Y, LAU T C, et al. Mutations outside the rifampicin resistance-determining region associated with rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis［J］. J Antimicrob Chemother, 2011,66(4):730-733.
［12］ JAMIESON F B, GUTHRIE J L, NEEMUCHWALA A, et al. Profiling of rpoB Mutations and MICs for Rifampin and Rifabutin in Mycobacterium tuberculosis［J］. J Clin Microbiol, 2014,52(6):2157-2162.