三种血管平滑肌细胞的体外培养

基金项目：广东省科技计划项目(编号：2012B031800448)
胡明亮：深圳市龙华新区人民医院 广东深圳 518109；
胡明亮 黄 莺 雷 艳 刘榕君 郑智华：中山大学附属第一医院 广东广州 510080
通讯作者：郑智华

三种血管平滑肌细胞的体外培养


胡明亮 黄 莺 雷 艳 刘榕君 郑智华
THREE CULTURED VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS IN VITRO
HU Mingliang, HUANG Ying, LEI Yan, et al

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  【摘 要】 目的 建立原代大鼠主动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。与人、牛血管平滑肌细胞及A7R5大鼠血管平滑肌细胞株形态比较。方法 健康SD大鼠1只，处死后分离中膜组织，剪细后加入培养液，在孵箱中适宜温度培养，培养后的细胞进行传代。观察细胞的生长形态及生长规律。并对细胞中表达的平滑肌肌动蛋白a(a-SMA)进行检测，鉴定所培养的细胞。同时观察人、牛血管平滑肌细胞及A7R5大鼠血管平滑肌细胞株生长形态。结果 细胞a-SMA表达丰富，牛原代血管平滑肌细胞形态较为舒展，人血管平滑肌细胞培养较难生长，A7R5形态较为单一，生长稳定，易于培养。结论 用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞是一种稳定、简便可行的实验方法。
  【关键词】 大鼠主动脉,血管平滑肌细胞,平滑肌肌动蛋白-a
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.08.009

  血管壁的主要成分是血管平滑肌细胞，而血管平滑肌细胞是ESRD患者动脉钙化过程中的关键细胞，所以血管平滑肌细胞的体外培养是ESRD的重要实验手段［1-3］。但有很多因素影响血管平滑肌细胞的体外培养，虽然用人VSMC作实验效果更显著，但是人VSMC的培养难度较大，细胞分离后会有较长的休眠期，最重要的是进入分裂期的细胞在体外生长增殖的成活率低，而且本身细胞数较少，细胞多次培养后发生损失的量大。目前使用较多的是大鼠的细胞［4-8］。大鼠的VSMC培养比较容易，用大鼠做实验，得到的实验结果与人类的结果比较接近，因为大鼠的形态学和生物学特征与人的细胞相近。本研究拟通过组织块贴壁法，建立稳定的大鼠动脉VSMC的体外培养模型，为开展相关的实验研究打下良好的基础。
     1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血管平滑肌细胞 SD大鼠血管平滑肌细胞取自体重在140~160 g之间的级SD雄性大鼠（由中山大学医学实验动物中心提供）的胸主动脉。健康新生小牛胸主动脉由蕊特生物有限责任公司提供，以培养牛血管平滑肌细胞（BVSMC），人主动脉平滑肌细胞（HASMC CRL-1999）采购于ATCC细胞库，A7R5大鼠血管平滑肌细胞株由伍军博士惠赠。
1.1.2 试剂 DMEM/F12（大鼠血管平滑肌细胞）、DMEM（牛及人血管平滑肌细胞）培养基、1 mL丙酮酸钠，2 mL谷氨酞胺、青霉素、DMEM/F12加10%~20%胎牛血清、链霉素、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶。谷氨酞胺、DMSO、丙酮酸钠。FITC标记的驴抗鼠二抗，抗平滑肌肌动蛋白a(a-SMA)抗体，碘化丙锭(PI)，75％乙醇、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素。
1.2 培养方法
     首先将大鼠处死，以试验中适合浓度的酒精对大鼠进行消毒。在确保没有细菌感染的情况下取出胸主动脉，迅速置于已经事先放置好相应药品的的小平皿中。在超净台上，观察血管，修整并顺着纵行方向切开动脉。置于一定湿度的木块上，用钝性的眼科弯镊刮除内皮细胞，去掉内膜面，继续刮擦至为两层的血管片，丢掉外层，保留透明韧性较好、较薄的中膜组织。无血清DMEM/F12清洗3次以上，然后取一干净小平皿，加少许胎牛血清后将血管片置于其中，继续用眼科剪数次剪切，将平滑肌层的血管片剪成很细的碎片。取带长吸头的吸管，将组织碎片吸到培养瓶底部，碎片之间距离不宜超过0.5 cm，布好碎片后将培养瓶底朝上，往培养瓶里加入5.0 ml含20%胎牛血清的培养液后，放于37 ℃孵箱内，培养瓶倒置2~3 h后将培养瓶缓慢翻转，放平，使组织块完全浸入培养液中，静置培养4～5 d。尽量减少移动以免影响组织块贴壁，4 d后换液，以后每2~3 d换液一次。相差显微镜常规观察细胞的生长形态及生长规律，在接种后的3 d可见组织块边缘有少量细胞爬出。约7~8 d后沿组织块边缘周围的细胞长满，贴壁细胞起伏呈典型的‘峰谷”样表现。当组织碎片周围的细胞长到一定密集时，按1∶ 1或1∶ 2，用0.25%的胰酶进行消化、传代，以后3~5 d可传一代。暂不用于实验的细胞加入细胞冻存液，逐步低温冷冻，液氮中保存备用。）取所需组织，较薄、透明韧性较好者为佳。放入培养液后培养，培养瓶置于恒温孵箱，4 d后换液，以后每2~3 d换液一次。暂不用于实验的细胞加入细胞冻存液，逐步低温冷冻，液氮中保存备用。
     牛血管平滑肌细胞原代培养：其中组织块剪为1 mm×1 mm×1 mm大小，余方法同上。
1.3 培养细胞的鉴定
     将消化传代的细胞以0.3×106/ml的密度接种于装有干净盖玻片的35 mm培养皿中，观察平滑肌肌动蛋白-α的表达具体流程如下:将爬片的细胞PBS洗涤；甲醇-20 ℃固定20 min，PBS洗涤；PBS+5%BSA室温下作用60 min，PBS洗涤；PBS+2% BSA+α-SMA(1∶100)4 ℃过夜，PBS洗涤；PBS+2% BSA+FITC标记的抗鼠二杭(1∶ 200)，室温下60 min，避光；PI染核，PBS洗涤；封片使用50％缓冲甘油；采用高倍显微镜进行观察，拍照。
     2 结果
     细胞生长形态：大鼠原代培养第3天，细胞的生长形态呈辐射状，较好地贴附于培养瓶周围。4～10 d细胞不断分裂，数量增多，细胞由于生长密集，而且数量较多，根本不能辨别细胞的形态，但是隐约可以观察到胞浆非常丰富，胞浆内暗黑色颗粒有时也可看到。此外，小部分的细胞之间有突起状相连，只是其胞体的形态比较小，此部分细胞的形态为较规则的梭子形状，细胞基质具有较强的折光性。当细胞生长至融汇后，细胞间会呈放射状，高低不一，这种“峰”、“谷”状生长特点在血管平滑肌细胞中更为明显。同部分文献报道类似［5］。
     牛原代血管平滑肌细胞一般在接种后7～8 d可见平滑肌细胞由组织边缘长出，再培养1~2 w细胞数量增多可传代，以后5～7 d可传一代，光学显微镜下细胞呈“峰-谷”状，而且紧贴培养瓶生长。与大鼠平滑肌细胞相比，细胞体积明显较大，形态舒展。人主动脉血管平滑肌细胞由ATCC取回后，培养4代以内7～8 d可传一代，形态大小介于牛和大鼠血管平滑肌细胞之间；5代以上生长明显减缓，甚至2～3 w都不能传代。A7R5大鼠血管平滑肌细胞与原代大鼠血管平滑肌细胞相比，形态较单一，呈梭形(图1)。a-SMA是一种标志蛋白，主要存在于血管平滑肌细胞中，经过免疫荧光检测，结果显示显微镜下细胞形态各异，成不规则形状排列，不过胞浆内可以发现大量的a-SMA，a-SMA沿细胞纵轴排列有密区，形态呈细丝状，这些就是平滑肌细胞的特征。

 注：A：原代大鼠血管平滑肌细胞（PRVSMC,第四代）；B：牛血管平滑肌细胞（PBVSMC,第四代）； C：A7R5大鼠血管平滑肌细胞株；D：人主动脉血管平滑肌细胞（HAVSMC,第四代）；（倒置显微镜,×100倍） 

图1 各种血管平滑肌细胞形态 
3 讨论
     目前血管钙化的发病机制和防治方法是研究的一个热点和难点，但是没有一个稳定的实验平台，所以可以转为研究大鼠平滑肌细胞的生物学行为来研究血管钙化。针对心血管疾病的研究，可以采用人、大鼠、牛等多种血管平滑肌细胞。鼠主动脉血管平滑肌细胞的原代培养主要有组织块贴壁法和消化法。消化法需要采用各种不同种类的消化酶类，常见的有胶原酶、胰酶等。消化法是要将组织进行消化、将组织分散。对于不同的动物组织，所用的消化酶的消化时间、消化操作过程也有很大的不同。而且胶原酶花费较大，实施的过程也繁复，所造成的实验成本高，此外还可能造成污染，引起细菌的感染。所以本实验采用组织块贴壁法，不但成本低而且操作简便，最重要的是成功率高，周期短。
     血管片的成功贴附是鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养的关键，我们的经验是：由于血管片越细越有利于贴壁成功和平滑肌细胞从组织中爬出，所以要将血管片剪切为针尖样大小；血管片悬空干涸贴壁2～3 h后翻转培养瓶，绝对静置培养4～5 d。其次，中层平滑肌层的分离非常重要，我们在木塞上，用镊钝性去除平滑肌的内膜面，然后稍用力分段横向刮压血管，血管片可分离为两层，可获得中膜组织，这样培养出的血管平滑肌细胞纯度高。
     在牛血管平滑肌细胞原代培养中，我们的体会是：①无菌条件下，需要将尽快培养在4 ℃ DMEM液中；②分离主动脉中层时应尽量将血管的内、外膜剥离干净;，为防止培养过程中血管内细胞污染，最好选取平滑肌层进行培养; ③培养的平滑肌的剪碎(1 mm×1 mm×1 mm)操作应在营养液中进行,剪切的组织块边缘要尽量整齐，以便于细胞的游出; ④组织块贴壁方法同大鼠血管平滑肌培养方法。国内外文献一般采用8~9代以内的大鼠、牛原代平滑肌细胞进行研究，因此在实验过程中多余细胞及时冻存，已达到避免盲目传代的目的。
     在人主动脉平滑肌细胞（HASMC）培养中我们发现，在完全培养液中培养3~4代之后，细胞生长明显减缓，较难培养。国内也有培养成功的报道［7］, 也有建议添加细胞生长因子才能维持较好的细胞形态，或者构建细胞株(HPV-E6E7) 可传20~30代［8］。观察大鼠血管平滑肌细胞株A7R5，我们发现其形态较为单一，生长稳定，易于培养。
     血管钙化的发病机制和防治方法的研究有助于相关血管疾病的治疗，众所周知，很多疾病的发作都与血管的钙化相关，比如循环系统，更加与血管的钙化息息相关。血管的钙化会使得血管的收缩和舒张受到限制，血液的循环出现障碍，引发心绞痛、高血压、心肌梗死等心脏病。针对心脏类疾病的治疗，一方面是要将血管内的油脂进行消化外，另外还要进行血管扩张，使血管的收缩和舒张更加自如。血液将营养物质运送到全身各处，也将机体内的废物输送到体外，血液贯穿着我们的全身，血管更是形成我们身体的一个网架，可见血管的健康极其重要，所以血管钙化的发病机制和防治方法的研究更是十分必要。
     综上所述，对于血管钙化的发病机制和防治方法的研究，用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞是一种稳定、简便可行的实验方法。

参考文献
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