PTEN和P27蛋白的表达在食管上皮增生和癌变过程中的意义

陈杰生：汕头市澄海区人民医院 广东汕头 515800
吴名耀：汕头大学医学院病理学教研室 广东汕头 515041

PTEN和P27蛋白的表达在食管上皮增生和癌变过程中的意义

陈杰生 吴名耀
THE SIGNIFICANCE OF EXPRESSION OF PTEN AND P27 PROTEINS IN ESOPHAGEAL EPITHELIOSIS AND CARCINOGENESIS
CHENG Jiesheng, WU Mingyao

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  【摘 要】 目的 研究食管黏膜上皮和癌旁组织中PTEN和P27蛋白的表达水平并探讨两种蛋白与食管癌发生的关系。方法 应用免疫组化方法，对60例食管癌切除标本的上切缘正常黏膜、癌旁黏膜上皮和原位癌进行PTEN和P27蛋白表达的检测。结果 PTEN和P27蛋白在正常、增生和恶变的食管黏膜上皮细胞表达逐渐减少，两者在食管癌变过程中显示相同的分布模式。结论 PTEN和P27蛋白表达的改变与食管黏膜上皮的恶性转化密切相关， PTEN和P27蛋白表达缺失可能是一个有用的生物学标志和食管癌早期诊断的指标。
  【关键词】 PTEN,P27,食管上皮,癌变过程

  【Abstract】 Objective To investigate the expression of PTEN and P27 proteins in esophageal epitheliosis and carcinogenesis, and the relation to the development of esophageal carcinoma. Methods PTEN and P27 proteins expression in 60 fresh tissue specimens, including esophageal mucosa above the upper surgical margin, carcinoma in situ and mucosa adjacent to tumor, were detected using immunohistochemical method. Results The expression of esophageal epithelial cells PTEN and P27 proteins in normal, hyperplastic and malignant gradually decreased, which showed a similar distribution pattern in esophageal carcinogenesis. Conclusion Malignant transformation expression change of PTEN and P27 proteins and esophageal mucosa are closely related, and the expression of PTEN and P27 proteins deletion may be a biological marker useful and esophageal cancer early diagnosis index.
     【Key words】  PTEN, P27, Esophageal epithelium, Carcinogenesis
     【Author′s address】 Chenghai people's Hospital of Shantou city, Shantou Guangdong, 515800, China
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.06.007

  食管癌是临床十分常见的恶性肿瘤，潮汕地区更是食管癌高发区。虽然目前针对食管癌有手术、放化疗等诸多手段，但是食管癌患者的生存预后情况却依旧无法令人满意。当前食管癌发病的确切原因和机理并未被完全阐明，而病人首次发现食管癌时均多为中晚期，往往错过最佳治疗时机。因此，提高对早期食管癌的诊断水平具有重大意义。越来越多的研究表明，恶性肿瘤的发生发展与特定癌基因及其产物的表达密切有关，先前有关PTEN和P27两种蛋白表达水平与食管癌发生发展之间关系的研究，发现该两种蛋白在癌旁黏膜和早期癌变的食管黏膜中的表达减少。PTEN基因全称为第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因，是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN蛋白的功能广泛，PTEN参与了人体的主要生理过程，它的突变、缺失在肿瘤的发生发展中起一定的作用。PTEN/P13K/AKT是在调节细胞凋亡、细胞增殖和细胞生长等多种生物学过程中一个重要的信号通路［1］。TACHIBANA M［2］等指出在食管癌中随着疾病的进展胞核PTEN表达是下调的，在食管鳞状细胞癌患者中，胞核的PTEN表达可能是一个良好的生物标记和预后指标。HIDLEBRANDT M等研究指出PTEN基因变异可预测复发的保护作用是明显的。P27是CKI家族中一员，是一种细胞周期负性调控因子，于1994年首次被克隆出来，P27蛋白表达减少，导致细胞周期失调控，S期细胞增多，DNA合成增强，细胞过度增殖、癌变。P27蛋白的低表达被认为是导致失调的生长、促进肿瘤进展的一个重要因素［3］。TONG Q［4］等研究认为P27与食管癌细胞放疗敏感性有关，P27表达下降可能是放疗抵抗的一个机制。低 P27蛋白的表达已被证明是许多恶性肿瘤一个不良预后因子。但目前有关于PTEN与P27蛋白在食管黏膜上皮和癌旁组织中联合表达的组织学定位和意义尚未见报道。有鉴于此，笔者运用免疫组化的方法检测PTEN和P27蛋白在食管黏膜上皮和癌旁组织中的表达情况，分析该两种蛋白与早期食管癌发生的联系。现报道如下。
     1 材料与方法
1.1 材料 采用我科食管癌手术切除标本存档蜡块60例，（2010年1月~2013年12月），毎例均选取上切缘黏膜和癌旁组织，入组病例（术前均未接受过放、化疗）临床资料完整。所有标本均用10%中性福尔马林液固定，用石蜡包埋，做连续切片，厚度为4 μm，常规HE染色区分类型。
1.2 方法 免疫组织化学染色：标本切片预先用二甲苯脱蜡及梯度酒精水化，后用3 % 过氧化氢去除内源性过氧化物酶，于微波炉内在0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中做抗原修复，一抗鼠抗人PTEN单克隆抗体 (6H2.1) 、兔抗人P27激酶抑制蛋白1单克隆抗体（SD51）和ivisionTMpoly-HRP羊抗鼠/兔二抗试剂购自Unicure公司（代购自广州深达生物制品有限公司）。选取正常小鼠、兔非免疫血清和缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照，选取随配的阳性切片作为阳性对照；DAB显色，苏木素复染，光镜下观察。
1.3 结果评价 PTEN和P27蛋白表达阳性评价标准：食管黏膜鳞状上皮细胞核、癌细胞核内见棕褐色颗粒。阳性程度评价标准：“+”：癌旁上皮阳性细胞在上皮层下1/3者；“++”：阳性细胞超过下1/3、但不超过下2/3者； “+++”：阳性细胞超过下2/3者。 
1.4 统计学方法 采用四格表2检验分析PTEN和P27蛋白表达情况。
     2 结果
2.1 病理组织形态 60份上切缘食管黏膜标本中仅20例为大致正常的食管黏膜，其黏膜上皮细胞在20～25层范围内，细胞无增生现象；在本研究中，60份癌旁黏膜上皮可见不同程度的细胞增生，根据细胞形态特征分为正常、单纯性增生、非典型性增生和原位癌4种。其中单纯性增生25 例，非典型增生28例，原位癌7例。
2.2 食管黏膜上皮及癌旁组织中PTEN和P27蛋白的表达及定位 经免疫组织化学染色后的上切缘食管黏膜及癌旁黏膜，阳性颗粒大部分位于上皮细胞核内，少数位于胞浆，呈浅棕色至深棕色。PTEN蛋白在正常黏膜上皮呈高表达，在病理组织被判断为正常、轻度不典型增生（图1）到重度不典型增生至癌变的四个区间内，PTEN蛋白表达的程度和强度依次递减，呈现规律性变化。P27蛋白在正常食管黏膜上皮中亦呈现高表达，而在癌旁单纯性增生黏膜的基底层细胞中也可经常见到阳性表达，在重度不典型增生的细胞（图2）中表达较少，在原位癌中则基本不表达。部分病例黏膜下淋巴细胞核也见PTENE和 P27阳性反应。PTEN和P27蛋白表达在食管癌变过程中显示相同的分布模式及染色情况。两种蛋白在不同类型食管组织的表达情况见表1和表2。

图1 基本正常的食管上皮，细胞核PTEN染色阳性。

苏木精对比染色(×200)

图2 单纯性增生食管上皮，细胞核P27染色阳性。

苏木精对比染色(×200)

图3 非典型增生食管上皮，细胞核 P27染色阳性。

EnVision法, 苏木精对比染色(×200)

图4 食管鳞状上皮原位癌，细胞核 PTEN染色阳性。

EnVision法, 苏木精对比染色(×200)
  表1 食管癌发生过程中PTEN蛋白的表达情况

(n,%)

组织学类型	n	+	++	+++	阳性率
正常黏膜	20	3	5	8	80.0
单纯性增生	25	2	5	12	76.0
非典型性增生	28	6	4	2	42.91)
原位癌	7	1	1	0	28.51)

 注:与正常和单纯性增生比较,1)p< 0.01
  表2 食管癌发生过程中P27蛋白的表达情况

(n,%)

组织学类型	n	+	++	+++	阳性率
正常黏膜	20	4	6	1	55.0
单纯性增生	25	8	4	0	48.0
非典型性增生	28	4	2	1	25.01)
原位癌	7	1	0	0	14.31)

 注:与正常和单纯性增生比较,1)p< 0.01
3 讨论
     PTEN，定位于染色体10ｑ23.3, 编码403个氨基酸组成的蛋白质，是近年来发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的新型抑癌基因。P27蛋白是细胞周期调控的负性调节因子，它能调控细胞周期中G/S期的转换，从而抑制细胞的增殖；其在细胞周期调控的作用越来越引起人们的关注，目前也普遍认为是一种抑癌基因。研究表明，PTEN在多种肿瘤中均呈现异常的表达，在恶性肿瘤中，基因的突变、缺失或甲基化均可以使PTEN失活，进而使PTENmRNA或蛋白表达降低，甚至不表达［5-7］。而当P27表达下降或缺失时，可导致基因组的不稳定，也可引起肿瘤的发生［3-4］。运用免疫组化的方法，本实验发现抑癌基因PTEN和P27蛋白在正常食管上皮、单纯性增生、非典型增生至原位癌中阳性表达率不同并呈现逐渐下降的趋势，PTEN和P27蛋白在非典型增生上皮和原位癌组织中的表达显著低于正常和单纯性增生上皮（p<0.01）。说明PTEN 和P27 蛋白的表达减少或缺失与食管癌的发生和进展密切相关，该两种蛋白表达的减少使食管上皮细胞的增殖受到的负性调控减弱从而过度增殖，进而发展成癌变。这一结果与某些作者在食管癌方面的实验结果基本一致［8-9］。
     目前，各方面学者有关PTEN蛋白在细胞中表达的定位（细胞核和/或细胞质）和阳性率的报道结果不尽相同。而在本实验中，结果则仅认可PTEN蛋白在细胞核区域内表达，与文献的报道一致［10-11］。这个结果可能与组织固定的不及时、抗原修复或所使用的抗体克隆不同存在一定关联性。已有文献报道，P27在食管鳞癌的表达阳性率在50% 左右，高于本组癌的阳性率，推测这可能是由于本组是非浸润癌，而非浸润癌和浸润性癌基因蛋白表达的不同，应在预料之中［12］。
     多基因参与了食管癌发生和发展的整个动态过程，PTEN和P27等多个基因及其蛋白在其中发挥了重要作用［12］。PTEN和P27同为抑癌基因，两者在基因表达调控和转录方面虽有所不同，但在食管上皮癌变过程中却显示相同的分布模式。目前在众多关于癌基因在肿瘤发病中扮演角色的研究中，基因协同假说尤其受到大家的重视，该假说认为，2个或2个以上的基因或基因蛋白通过激活或不表达的方式，在整个恶性肿瘤的发生、发展和转移过程中，协同促进了细胞的恶变，但其中具体的协同机制目前却不甚清楚。本研究结果显示：在食管黏膜上皮癌变过程中，癌旁黏膜上皮PTEN和 P27 表达的渐进性减少与食管上皮的癌变有着密切的联系，当PTEN和P27蛋白的表达降低或者呈阴性表达时，则提示有食管癌病变的可能，进一步证实了基因的协同假说［7，14］。而在具体操作的技术层面，运用免疫组织化学方法检测PTEN和P27蛋白的表达，不仅具有检测准确，定位精确等优点，同时还具有操作简便，可进行回顾性研究和重复检测等特点。因此，食管黏膜上皮PTEN和P27蛋白表达的联合检测可望成为食管癌早期极具价值的诊断指标之一。

参考文献
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