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晚期非小细胞肺癌组织中BRCA1、RAP80的表达与化疗疗效的关系

【】2015-07-23 点击次数
基金项目:广东省科技计划项目(编号:粤科规划字[2012] 145号)
张贤兰 黎少琴 苏 宁 薛丽京 刘 燕:广州市胸科医院 广东广州 510095

晚期非小细胞肺癌组织中BRCA1、RAP80的表达与化疗疗效的关系

张贤兰 黎少琴 苏 宁 薛丽京 刘 燕
BRCA1 AND RAP80 EXPRESSIONS IN STAGE Ⅲ-IV NON-SMALL CELL LUNG CANCER AND THEIR RELATIONSHIP WITH CHEMOTHERAPY EFFECTS
ZHANG Xianlan, LI Shaoqin, SU Ning, et al


  【摘 要】 目的 研究人类乳腺癌易感基因(BRCA1)及受体相关蛋白80(RAP80)在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其与化疗疗效的关系。方法 应用免疫组织化学(IHC)方法检测62例经病理确诊为晚期NSCLC患者石蜡切片标本中BRCA1及RAP80蛋白表达的情况,分析其与吉西他滨联合顺铂(GP)方案化疗疗效的关系,同时分析BRCA1 与RAP80 表达水平的相关性。结果 BRCA1及RAP80蛋白表达在不同年龄、性别、吸烟史、PS评分、病理类型、TNM分期组中无明显差异;BRCA1和RAP80蛋白表达阴性组GP方案化疗有效率高于蛋白表达阳性组,两组比较差异有统计学意义(p<0.05);BRCA1与RAP80的表达呈正相关(γ=0.625, p<0.01)。结论 BRCA1及RAP80蛋白表达阳性与铂类耐药有关; BRCA1与RAP80的表达呈正相关,提示BRCA1通过RAP80参与DNA修复。
  【关键词】 乳腺癌易感基因1,受体相关蛋白80,非小细胞肺癌

  【Abstract】 Objective To analyze associations of gemcitabine-platinum chemotherapy effects with BRCA1 and RAP80 expressions in Ⅲ-IV non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The immunohistochemical method was used to detect expression of BRCA1 and RAP80 in 62 patients with Ⅲ-IV NSCLC.Chi‐square test was used to evaluate the association of chemotherapeutic effect with BRCA1 and RAP80 expressions. Spearman relationship was conducted to evaluate the associations among expression of BRCA1 and RAP80. Results In these 62 cases, positive expression of BRCA1 and RAP80 had no correlation with age, gender, smoking, PS score, pathology and clinical stage. The patients with negative BRCA1 and RAP80 expression in Ⅲ-IV NSCLC were more sensitive to gemcitabine-platinum chemotherapy compared with patients with positive BRCA1 and RAP80 expression. There were statistical differences (p<0.05);The expression levels of BRCA1 and RAP80 were positive correlated (r=0625, p<0.01). Conclusion Positive BRCA1 and RAP80 expression are correlation with platinum resistance; The expression of BRCA1 and RAP80 were positive correlated, which showed that BRCA1 repaired DNA through RAP80 participation.
     【Key words】  Breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1), Receptor-associated protein 80(RAP80), Non-small cell lung cancer
     【Author′s address】 Guangzhou chest hospital, Guangzhou, 510095, china
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.06.005

  晚期肺癌患者诊断时即失去手术等根治的机会,治疗方式以全身姑息治疗为主,亦即以化学药物治疗和分子靶向药物治疗为主。随着基础研究及临床研究的一系列进展,肺癌个体化治疗的观念逐渐深入临床,目前晚期NSCLC患者一线标准的化疗方案为含铂的两药方案,中位OS在7~9个月左右,1年生存率在30%~40%,但是临床实践中观察到不同患者之间的疗效相差较大。本研究拟选取晚期NSCLC患者,获得癌组织后检测BRCA1及RAP80蛋白表达水平,分析一线化疗疗效与BRCA1及RAP80蛋白表达的相关性。现报道如下。
     1 资料与方法
1.1 临床资料
     收集广州市胸科医院2012~2014年经组织病理诊断为III~IV期NSCLC的石蜡包埋组织标本62例,其中男性54例(871%),女性8例(129%),中位年龄41~74岁,病理鳞癌18例(29%),腺癌42例(677%),大细胞癌2例(32%),按照AJCC分期第六版进行分期,IIIA期33例(532%),IIIb期17例(274%),IV期12例(193%)。
1.2 治疗方法
     采用GP方案:吉西他滨1 250 mg/m2,静脉滴注,第l天、第8天;顺铂75 mg/m2,第l天至第3天静脉滴注。所有的方案每3周重复1次,共4个疗程。第2个疗程和第4个疗程结束后复查CT以进行疗效评价。4个疗程化疗结束后进行随访。所有患者每2~3个月随访一次。
1.3 疗效评价标准
     按RECIST方法实体瘤客观疗效评价标准判断化疗疗效。完全缓解(CR):治疗后病灶完全消失,且持续≥4周无新病灶出现;部分缓解(PR):病灶缩小≥30%,且持续≥4周无新病灶出现;稳定(SD):病灶无明显变化,包括病灶缩小不到30%或增大≤20%;进展(PD):病灶增大≥20%或出现新病灶。CR+PR为有效,SD+PD为无效。
1.4 免疫组织化学
     组织标本均经10%甲醛固定,常规石蜡包埋,5 um连续切片,常规脱蜡水化后进行预处理,以3%的H202,去离子水孵育10 min,阻断内源性过氧化物酶,蒸馏水洗3次,每次2 min;分别滴加兔抗人BRCA1单克隆抗体(1∶ 100稀释)和兔抗人RAP80单克隆抗体(1∶ 100稀释),室温孵育1~2 h,蒸馏水洗3次,每次2 min;滴加二抗工作液,37℃孵育20~30 min,蒸馏水洗3次,每次2 min;滴加三抗工作液,37℃孵育20~30 min,蒸馏水洗3次,每次2 min;DAB显色5 min,自来水充分冲洗;苏木精复染,脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,编号。
1.5 免疫组化结果判断标准
     BRCA1阳性表达主要位于细胞浆,为棕黄色颗粒。RAP80阳性表达主要位于细胞核,为棕黄色颗粒。免疫组化的结果判断由2位病理科医师(其中一位为主任医师),在不知道患者临床资料的情况下,对标本染色结果进行判断。高陪镜下(400×),随机统计1 000个肿瘤细胞中的阳性细胞数,计算阳性细胞百分率。参照WACHTERS等[1]方法来判断BRCA1、RAP80的表达,阴性表达(-):不表达或阳性细胞数≤10%;阳性表达(+):阳性细胞>10%。
1.6 统计学处理
     应用SPSS 13.0软件对各组数据统计分析,计数资料的分析采用2检验,相关性分析采用Spearman双变量相关分析,p<005表示有统计学意义。
     2 结果
2.1 BRCA1和RAP80蛋白表达
     在NSCLC组织中BRCA1蛋白表达定位于肿瘤细胞浆内,阳性染色者在细胞浆内有棕黄色颗粒沉着(图1),染色结果显示BRCA1蛋白阳性表达者37例,BRCA1蛋白阴性表达者为25例,阳性表达率是596%(37/62); RAP80蛋白表达定位于肿瘤细胞核内,阳性染色者在细胞核内有棕黄色颗粒沉着(图2),染色结果显示RAP80蛋白阳性表达者35例,阴性表达者为27例,阳性表达率是564%(35/62)。


2.2 BRCA1和RAP80蛋白表达和患者临床特征之间的关系
     BRCA1蛋白表达在不同年龄、性别、吸烟史、PS评分、病理类型、TNM分期组之间比较均无统计学差异(p>0.05)。 见表1。

表1 BRCA1和RAP80蛋白表达与临床特征的关系

n(%)

临床特征 BRCA1(+) BRCA1(-) p RAP80(+) RAP80(-) p
年龄(年)     0.253     0.832
 >60(25) 15(60.0) 10(40.0)   14(56.0) 11(44.0)  
 ≤60(37) 22(59.4) 15(40.6)   21(56.7) 16(43.3)  
性别     0.056     0.345
 男(54) 32(59.2) 22(40.8)   30(55.6) 24(44.4)
 女(8) 5(62.5) 3(37.5)   5(62.5) 3(37.5)  
吸烟史     0.325     0.632
 吸烟(37) 22(59.4) 15(40.6)   21(56.7) 16(43.3)  
 不吸烟(25) 15(60.0) 10(40.0)   14(56.0) 11(44.0)
PS评分     0.075     0.066
 0+1(56) 33(58.9) 23(41.1)   31(55.3) 25(44.7)  
 2(6) 4(66.6) 2(33.4)   4(66.6) 2(33.4)  
病理类型     0.412     0.124
 腺癌(42) 25(59.5) 17(40.5)   23(54.7) 19(45.3)  
 鳞癌+大细胞癌(20) 12(60.0) 8(40.0)   12(60.0) 8(40.0)  
TNM分期     0.086     0.254
 Ⅲ(50) 30(60.0) 20(40.0)   28(56.0) 22(44.0)  
 Ⅳ(12) 7(58.3) 5(41.7)   7(58.3) 5(41.7)  

2.3 BRCA1蛋白表达与化疗疗效之间的关系
     62例患者接受GP方案化疗后ORR为33.87%(21/62)。BRCA1蛋白阴性组化疗后ORR为520%(13/25),BRCA1蛋白阳性表达组化疗后ORR为21.6%(8/29),两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。见表2。提示BRCA1蛋白阴性组含铂药物化疗疗效优于阳性组。

表2 BRCA1表达与化疗疗效的关系

(n,%)

组别 例数 有效
(CR+PR)
无效
(SD+PD)
有效率
(ORR)
BRCA1阳性组 37 8 29 21.6
BRCA1阴性组 25 13 12 52.0
合计 62 21 41 33.87

2.4 RAP80蛋白表达与化疗疗效之间的关系
     RAP80蛋白表达阴性组化疗后ORR为44.4%(12/27),RAP80蛋白阳性表达组化疗后ORR为28.6%(10/35),两组比较差异有统计学意义(p<0.05),见表3, 提示RAP80蛋白阴性组含铂药物化疗疗效优于阳性组。

表3 RAP80表达与化疗疗效的关系

(n,%)

组别 例数 有效
(CR+PR)
无效
(SD+PD)
有效率
(ORR)
RAP80阳性组 35 10 25 28.6
RAP80阴性组 27 12 15 44.4
合计 62 21 41 35.48

2.5 BRCA1和RAP80蛋白表达的相关性
     BRCA1和RAP80蛋白同时高表达的患者有15例,同时低表达的18例,BRCA1高表达而RAP80低表达的有14例,BRCA1低表达而RAP80高表达的共15例,两者的表达水平呈正相关(γ=0.625, p<0.01)。
     3 讨论
     化疗相关分子标志物的研究近年来进展迅速。其中BRCA1是一个有潜在研究价值的指标。BRCA1是第一个被发现的家族性乳腺癌易感基因,该基因定位于人染色体17q21,全长约100 kb,编码1 863个氨基酸及其对应的220 kD的核磷蛋白。BRCA1主要通过DNA修复、mRNA转录、细胞周期的调节以及蛋白泛素化等途径参与细胞的各种应答反应。由于大多数化疗药物均通过直接或者间接的DNA损伤来发挥抗肿瘤作用,所以BRCA1在化疗药物所导致的DNA损伤及其对这些药物疗效预测方面的价值得到了广泛的关注。
     基础研究显示,与亲代细胞相比,顺铂耐药细胞系的BRCA1表达水平明显提高。通过干扰抑制BRCA1的表达可使细胞对顺铂的敏感性明显增强[2]。2004年西班牙肺癌协作组(SLCG)报道在接受CDDP/GEM新辅助化疗的NSCLC患者中,BRCA1低表达患者中位生存时间尚未观察到,中表达患者中位生存时间为37.8个月,而高表达患者中位生存时间仅为12.7个月[3]。而BRCA1及RAP80均低表达的患者TTP高达14个月,远远超过所有常规化疗晚期肺癌的TTP(均不超过7个月)[4]。本研究结果也提示BRCA1及RAP80均低表达的患者化疗疗效较高表达者好。BRCA1表达阴性者的GP方案化疗有效率(520%)高于阳性者(21.6%)(p<0.05), RAP80蛋白表达阴性患者GP方案化疗有效率达44.4%,而阳性表达患者有效率只有28.6%,提示BRCA1和RAP80蛋白表达阳性的NSCLC患者对铂类耐药,同时发现BRCA1和RAP80的表达与患者性别、年龄、临床分期、吸烟指数以及病理类型无关,这与鲁小敏等[5]的研究一致。
     2007年Science杂志发表的研究证实BRCA1通过RAP80参与DNA修复,后者在DNA损伤途径修复中发挥关键作用。RAP80与聚集在DNA损伤微点的特定类型泛素结合,将BRCA1靶定位到DNA断裂位点,从而使得BRCA1复合物能够到达损伤位点,在正常的DNA损伤修复反应中起关键作用。另外,RAP80还能特异性地与BRCA1一起在细胞周期的G2/M检控位点处起作用[6-8]。ROSELL等研究发现BRCA1表达水平与患者的无病生存时间DFS相关:基因表达水平高的患者DFS短,预后较差[9]。JOERGER等分析了GP方案化疗后晚期肺癌患者组织中BRCA1、ERCC1、RAP80等指标的表达,发现在所有BRCA1表达的患者中,RAP80与中位OS显著相关,RAP80是预测BRCA1表达肺癌患者OS的显著指标[10]。 本研究显示BRCA1和RAP80蛋白同时高表达的患者有15例,同时低表达的18例,两者的表达水平呈正相关(γ=0.625, p<0.01),显示瘤内BRCA1高表达者同时也伴有RAP80高表达,提示BRCA1通过RAP80参与DNA修复,与徐露娟等[11]研究观察到进展期NSCLC癌组织中BRCA1 mRNA与RAP80 mRNA的表达呈正相关一致。
     综上述研究提示晚期NSCLC 癌组织中BRCA1和RAP80的蛋白表达与化疗疗效相关, BRCA1通过RAP80参与DNA修复,研究BRCA1及RAP80在晚期NSCLC中化疗疗效的预测作用,为后续开展可能的前瞻性研究提供参考数据。BRCA1和RAP80的蛋白表达水平目前已成为NSCLC个体化化疗的重要分子标记和预后指标,本研究后续需进一步随访生存期及扩大样本量以证实BRCA1及RAP80在NSCLC预后中的指导作用。

参考文献
[1] WACHTERS F M,WONG L S,TIMENS W,et a1.ERCCl,hRad51,and BRCAI protein expression in relation to tumoⅢFesponse and survival of stage Ⅲ/IV NSCLC patients treatedwith chemotherapy[J].Lung Cancer,2005,50(2):211-219.
[2] SYLVAIN V, LAFARGE S, BIGNON YJ. Dominant-negative activity of a BRCA1 truncation mutant: effects on proliferation, tumorigenicity in vivo, and chemosensitivity in a mouse ovarian cancer cell line[J]. Int J Oncol, 2002, 20:845-853.
[3] WANG B, MATSUOKA S, BALLIF BA, et al. Abraxas and RAP80 form a BRCA1 protein complex required for the DNA damage response[J]. Science,2007,316:1194e8.
[4] KIM H, CHEN J, YU X. Ubiquitin-binding protein RAP80 mediates BRCA1-dependent DNA damage response[J]. Science,2007,316:1202-1205.
[5] YAN J, KIM YS, YANG XP, et al. The ubiquitin-interacting motif containing protein RAP80 interacts with BRCA1 and functions in DNA damage repair response[J]. Cancer Res,2007,67:6647-6656.

(下转第16页)(上接第13页)
[6] TARONM, ROSELLR, FELIPE, et al.BRCA1mRNA expressionlevels as an indicator of chemoresistance in lung cancer[J]. Hum Mol Genet, 2004,13(20):2443-2449.
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[9] JOERGER M,DEJONG D,BURYLO A,et al.Tubuline, BRCA1, ERCC1, Abraxas, RAP80 mRNA expression, p53/p21 immunohistochemistry and clinical outcome inpatients with advanced non small cell lung cancer receiving first-line platinum-gemcitabine chemotherapy[J]. Lung Cancer, 2011,11:310-317.
[10] 鲁小敏,茅国新,吉浩明.BRCA1在非小细胞肺癌中的表达及其与铂类化疗敏感性的关系[J]. 实用医学杂志,2010,26(19):3526-3528.
[11] 徐露娟,魏 嘉,禹立霞,等. 进展期非小细胞肺癌BRCA1mRNA和RAP80mRNA表达水平与临床病理特征的关系[J]. 中国癌症杂志,2011(11):821-827.

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