YB-1在子宫内膜异位症中的表达

基金项目：广东省科技厅科研基金资助项目（编号：201213031800337）
赖晓岚 华 兴 林碧君：暨南大学医学院第四附属医院/广州市红十字会医院 广东广州 510220

YB-1在子宫内膜异位症中的表达


赖晓岚 华 兴 林碧君
EXPRESSION OF YB-1 IN ENDOMETRIOSIS
LAI Xiaolan， HUA Xing， LIN Bijun

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  【摘 要】 目的 探讨YB-1在子宫内膜异位症（EMs）患者血清及子宫内膜组织中的表达及意义，以期将YB-1作为EMs早期诊断和治疗的判定指标。方法 采用ELISA 法检测EMs组与对照组血清中YB-1的表达水平，采用免疫组化SP法检测两组子宫内膜组织中YB-1的表达情况。结果 与对照组（964±237 ug/L）相比，EMs组患者血清 YB-1 的平均浓度（1465±391 ug/L）较高，二者相比差异有统计学意义（p<005）。免疫组化结果显示YB-1在EMs组患者子宫内膜中主要呈中等强度阳性表达。正常子宫内膜中也可见YB-1的少量弱阳性表达，两组子宫内膜组织中YB-1的阳性表达率相比有明显差异（p<005）。结论 YB-1在EMs患者血清及子宫内膜组织中高表达，其不仅可作为EMs细胞内的标志物，也有望成为一个理想的血清学标志物。
  【关键词】 YB-1,子宫内膜异位症,血清,子宫内膜,表达

  【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of YB-1 in serum and endometrial tissues in patients with endometriosis (EMs) for taking YB-1 EMs as an index of early diagnosis and treatment. Methods ELISAwas adopted to detect YB-1 expressions in serum of EMs group and control group. The expression of YB-1 in endometrial tissue in the EMs group and control group was detected by immunohistochemistry SP method.Results The average concentration of YB-1 in serum of EMs group (14.65±3.91 ug/L) was higherthan thatin the control group (9.64±2.37 ug/L), with statistically significant differences (p<0.05). The results of immunohistochemistry showed that the expression of YB-1 was moderately positive in endometria of patients with EMs.Weakly positive expressions of YB-1 were detected in a fewcases of the control group. There are significant differences in the positive expression rates of YB-1 between two groups(p<0.05). Conclusion The expression of YB-1 in serum and endometria of patients with EMs is higher. YB-1 can not only be an intracellular marker, but also expected to become an ideal serological marker.
     【Key words】  YB-1, Endometriosis, Serum, Endometrium, Expression
     【Author′s address】 The Fourth Affiliated Hospital of Jinan University of Guangzhou Red Cross Hospital, Guangzhou 510220, Guangdong Province, China 
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.03.009

  子宫内膜异位症（Endometriosis, EMs）是妇科的常见病、多发病，是指具有生长活性的子宫内膜在子宫腔以外的部位种植及浸润，且有浸润、转移和复发的恶性生物学行为，成为难治之症，严重影响妇女的生理、精神和社会健康状态［1］。育龄女性的EMs发病率约为5%~10%［2］。其发病机制尚未完全明确，EMs的治疗仍然是一个棘手问题。 YB-1（Y 盒结合蛋白-1）在转录调节、翻译调控、mRNA 选择性剪接、DNA 的修复、细胞增殖和再生等过程中发挥多种重要的生物学功能；已发现人类多种疾病特别是肿瘤中 YB-1 蛋白都异常表达，并且在疾病的发生、演进、转移等方面都发挥着重要的作用［3-5］。
     笔者通过研究YB-1在EMs患者血清及子宫内膜组织中的表达，探讨其在EMs发病中所起的作用，以期将YB-1作为EMs早期诊断和治疗的判定指标。现报道如下。
     1 对象与方法
1.1 研究对象
     EMs组：选取2012年10月～2014年3月在广州市红十字会医院妇产科行腹腔镜手术治疗或子宫切除术后并经病理学检查确诊为EMs的患者的子宫内膜组织和患者血清各40例，患者年龄20～47岁，平均年龄（3458±612）岁；对照组：选取同期在该院因子宫畸形、不孕症、良性肿瘤等行腹腔镜手术治疗或子宫切除手术患者的正常子宫内膜及血清各40例，患者年龄18～44岁，平均年龄（3376±439）岁。两组患者一般资料比较无明显差异，具有可比性。纳入标准：①生育期女性；②月经周期正常；③手术前6个月无激素治疗史；④无恶性肿瘤病史。
     所有研究对象采集标本前均已签注知情同意书，并已排除血液性疾病、其他内分泌疾病及肿瘤性疾病。
1.2 血清标本采集及测定
     所有研究对象均清晨空腹肘静脉采血5mL，迅速离心后分离血清并置于-80℃冰箱中保存备用。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法检测血清中 YB-1水平。具体操作步骤严格按YB-1 ELISA试剂盒说明书(购自博士德生物工程有限公司)进行。所有样品均设3个重复组，以减少误差。
1.3 免疫组织化学染色
     采用免疫组化SP法对所有标本进行检测。取EMs组及对照组子宫内膜，经10%多聚甲醛固定，PBS洗涤，不同浓度梯度乙醇脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚约0.5 um。免疫组化操作具体流程严格按照试剂盒说明书进行操作。YB-1为羊抗人多克隆抗体，稀释浓度为1∶ 200，购自SANTA公司。阴性对照为代替一抗的PBS缓冲液，阳性对照为试剂公司所提供阳性切片。
     观察结果时采用双盲法，应用OLYMPUS-IX83倒置荧光显微镜观察细胞染色情况，以细胞浆中出现棕色或棕黄色颗粒为阳性表达细胞，无着色反应为（-），按细胞着色深浅程度不同分为：弱阳性（+）为浅黄色，中等强度阳性（++）为棕黄色，强阳性（+++）为棕褐色。
1.4 统计学方法
     应用 SPSS 190软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，计量资料的组间比较采用t检验，计数资料比较采用2和Yates校正2检验，以p<0 05为差异有统计学意义。
     2 结果
2.1 血清中YB-1水平的表达
     应用ELISA法检测，结果显示，与对照组结果（964±237 ug/L）相比，EMs组患者血清YB-1 的平均浓度（1465±391 ug/L）较高，二者相比差异有统计学意义（p<005），见表1。
   表1 两组患者血清YB-1水平比较

［n,（±s）］

组别	例数	血清YB-1水平（ug/L）
对照组	40	9.64±2.37
EMs组	40	14.65±3.911)

 注：与对照组比较，1)p<0.05
2.2 子宫内膜组织中YB-1的表达
     免疫组化染色后，经显微镜下观察可见在EMs组患者子宫内膜中YB-1主要分布在细胞浆中，细胞核中可见少量分布，其表达强度以中等强度阳性多见。正常子宫内膜中也可见YB-1的少量弱阳性表达，两组子宫内膜组织中YB-1的阳性表达率相比有明显差异（p<0.05），见表2，图1、图2。

表2 YB-1在子宫内膜中的表达

（n，%）

组别	例数	YB-1	阳性率
		－	＋	＋＋	＋＋＋
对照组	40	35	3	2	0	8.8
EMs组	40	14	5	12	9	65.01)

 注：与对照组比较，1)p<0.05

图1 对照组子宫内膜腺上皮细胞中YB-1表达为阴性 (SP×200)

图2 EMs组子宫内膜腺上皮细胞中YB-1表达为中等强度阳性 (SP×200)
3 讨论
     EMs病理组织学上虽然是良性的，却有播散、种植、浸润、转移及治疗后高复发率等恶性行为，被称为良性癌［6］。约有10%~15%的育龄妇女患病，其广泛分布的病灶，呈现多种形态,病灶会广泛累及盆腔内外多个脏器，并引起不同程度的临床症状，如慢性盆腔疼痛、不孕以及盆腔包块［7］，严重影响患者生活质量。
     自SAMPSON提出经血逆流种植学说这一经典理论以来，各国学者已经对子宫内膜异位症进行了数十年的不懈探索，从组织细胞到蛋白表达，从激素代谢、黏附侵袭、血管及神经组织生长到免疫系统异常等各方面进行了大量的研究［8］。随着生物遗传学和基因芯片技术的发展，逐渐开始关注EMs患者的基因学改变。目前认为EMs是由多个基因位点与环境因素间相互作用引起的多基因遗传疾病。利用基因芯片技术研究EMs目前主要应用于进行基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变及多态性分析、疾病诊断和分型、药物筛选、基因测序等［9-11］。虽然许多相关基因已被发现，但尚未找到关键性的基因，缺乏高灵敏度及特异度的诊断性分子标志物，缺乏预测EMs严重程度和评价疗效及复发的分子标志物。
     YB-1是Y-盒蛋白家族成员之一，是能够特异性结合目的基因启动子和增强子内部Y-box 序列（CTGATTGGCCAA）的一类转录因子，也是一类高度保守的顺式作用元件，普遍存在于原核和真核生物细胞中。YB-1 在转录调节、翻译调控、mRNA 选择性剪接、DNA 的修复、细胞增殖和再生等过程中发挥多种重要的生物学功能。当受到外界的各种不良刺激后，细胞活化，细胞中的 YB-1 出现过度表达；BJRN C. FRYE等研究证实，肿瘤细胞凋亡、坏死以及循环肿瘤细胞的破坏裂解，可释放入血液循环中，并采用 Western Blot方法定性检测血浆中 YB-1，证实健康人及肿瘤患者血清中均存在YB-1［12］。
     既然YB-1能在血清中检测到，那么YB-1是否可以作为EMs患者的血清学标志物呢？通过我们对非EMs和EMs患者血清中YB-1的ELISA法定量检测显示，EMs患者血清中YB-1高表达，具有与肿瘤相似的特性，提示 YB-1不仅可作为EMs细胞内的标志物，也可作为一个理想的血清EMs标志物，而血清标志物在取样和定量检测上具有显著的优势。最近有学者报道：EMs患者的在位内膜，异位内膜组织和细胞以及腹壁的巨噬细胞内均有YB-1蛋白高表达 ［13］。本研究通过对子宫内膜组织的免疫组化染色，结果显示YB-1在EMs患者子宫内膜组织中有表达，表达强度以中度阳性为主，部分呈强阳性，与报道结果一致。通过对血清及子宫内膜组织中YB-1的检测，进一步证实了YB-1高表达与EMs具有明显相关性，在今后的工作中可以作为EMs诊断与治疗中的一项检测指标，但其具体的作用机制目前仍不清楚，有报道认为其在促进细胞的粘附、增殖和促进细胞发生恶性变中起重要作用［14］。但其确切机制仍有待进一步研究，。
     目前检测YB-1蛋白的方法多为Western Blot 或免疫组化染色技术定性检测，或以RT-PCR、基因芯片半定量检测 YB-1 mRNA 表达。这些检测手段均需要组织取材，而且对检测技术要求较高，程序繁琐，使得众多中小医院，特别是基层医院难以实施，使EMs的诊治受到限制。血清学ELISA检测YB-1的方法具有样本采集方便，病人依从性好，定量分析，易于推广等显著优点，有助于临床医生对子宫内膜异位症进行诊断、分期，做到术前充分评估，制定合理治疗方案，术后根据血清YB-1 水平实时监控和预测复发倾向。血清学YB-1水平检测将是一个具有良好的社会效益和经济效益，易于推广普及的对子宫内膜异位症进行诊断、分期，预测预后及复发的血浆标志，并为进一步探讨血液中YB-1水平在EMs发生发展中的作用机制奠定了基础。我们将进一步扩大样本量，探讨YB-1水平与EMs分期、临床预后、复发之间的内在联系。
    

参考文献
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