水通道蛋白1和细胞角蛋白7在卵巢肿瘤中表达的研究

郑晓霞 陈佩珊 张燕梅：汕头大学医学院第二附属医院 广东汕头 515041

水通道蛋白1和细胞角蛋白7在卵巢肿瘤中表达的研究

郑晓霞 陈佩珊 张燕梅
EXPRESSION OF AQUAPORIN 1 AND CYTOKERATIN 7 IN OVARIAN TUMORS
ZHENG Xiaoxia, CHEN Peishan, ZHANG Yanmei

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  【摘 要】 目的 通过探究在卵巢肿瘤中细胞角蛋白7（CK7）及水通道蛋白1（AQP1）两者的表达状况，分析AQP1和CK7的相对应的关系以及探究两种相应的蛋白对发生与发展在卵巢肿瘤中的一系列作用。对在早期诊断以及治疗卵巢癌的新靶点以及防治后的评价给予了一定程度的依据。方法 取住院接受手术治疗并确诊为卵巢癌57例作为研究组；从卵巢交界性上皮性肿瘤患者、转移性卵巢癌患者、卵巢良性上皮性肿瘤患者以及正常卵巢组织中分别选取12、8、15、10例作为对照组患者。检查以上这些患者的肿瘤组织（如：卵巢癌、卵巢良性上皮性肿瘤组织、卵巢交界性上皮性肿瘤）中的AQP1、CK7的表达状况和在正常卵巢组织中AQP1 、CK7的表达状况。结果 在不同种类卵巢肿瘤组织中AQP1及CK7在表达上呈阳性机率之间的比较差异都具有统计学意义（P<005）。卵巢上皮性癌中APQ1 与CK7的表达成正比例关系。结论 CK7和AQP1都共同配合与参与了卵巢肿瘤的引发和发展这些过程。
  【关键词】 卵巢肿瘤,水通道蛋白1,细胞角蛋白7
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.12.010 

  如今对于在初期诊断卵巢癌所采用的方式仍然没有很大成效。因此大部分患者一旦察觉、发现有此病症时就有很大可能是中期或是晚期卵巢癌。其中转移性卵巢癌发病时症状很不明显，危害性很大，在后期的防治方面效果也很差，一旦发现，五年之内死亡率也极其高，高达70%以上。所以一方面要降低此病症给病患带来生命威胁的机率也要在另一方面提高医护人员对其的预后措施质量，相关学者应该研究有关卵巢癌在生物学上的基本特点，来深入分析此病症的特点以及发病的原因，尽可能寻找出可以有效的在初期诊断出卵巢癌的方式。本研究通过患者的肿瘤组织（如：卵巢交界性上皮性肿瘤、卵巢癌、卵巢良性上皮性肿瘤组织）中的AQP1、CK7的表达状况和在正常卵巢组织中AQP1 、CK7的表达状况以及它们之间的相互关系，来探究在卵巢肿瘤发生之时AQP1与CK7对发病的作用。它可能为诊断患者是否是卵巢癌开创了一个更高的境地。它有效地指导了评估和改善预后这两项工作。
     1 资料与方法
1.1 一般资料
     由2010年1月～2014年1月在汕头大学医学院第二附属医院妇科经手术处理并得到相应专家确实的浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、内膜样癌、透明细胞癌分别有22例、18例、15例与2例，一共有57例患者被选择为研究组。其中高、中、低分化（G1、G2、G3）分别有17例、22 例和18例患者。手术按照相关的病理区分期间阶段（国际妇产联盟FIGO,2000）：有22例Ⅰ～Ⅱ期，有35例Ⅲ～Ⅳ期。依据手术后患者腹水的程度分为两种状况：腹水与无腹水分别有37例与20例。选取10例正常卵巢组织(其中有5例是从一侧卵巢癌的对侧正常卵巢的病例中选取，有5例是从子宫内膜癌切除的卵巢的病例中选取)，将15例卵巢良性上皮性肿瘤患者、12例交界性肿瘤与8例转移性卵巢癌选取为对照组患者。
1.2 方法
     采用二步骤免疫组化Envision的方法，探究方式步骤严格依据免疫组化检测方法的步骤。选取探究材料：采用4%的体积分数的多聚甲醛液去固定，利用基本方式使其脱掉水分，用石蜡去包裹并埋入，连续做切片工作，切2张厚度为4～6 μm的切片。两张切片依次进行不同染色应用，分别为免疫组织化学染色应用和苏木素伊红染色，兔抗人AQP1单克隆抗体试剂盒是在SANTA公司购买到的，CK7试剂都是在迈新公司购买到的。染色：将石蜡切片梯度酒精脱水后，采用3％过氧化氢孵育10 min之内，10 min微波修复抗原，再滴加非免疫血清，利用室内温度孵育15 h，加入1∶ 200 兔抗人AQP1 和鼠抗人CK7多克隆抗体，在4℃温度下过夜，采用苏木素与DAB显现颜色以及再次染色，然后封切片。用PBS代表3种一抗、用已知阳性组织切片分别作为对阴性与阳性的对照。
1.3 结果判读
     CK7和AQP1阳性染色都呈现了棕黄色颗粒或弥漫性分布，位居于细胞膜或细胞浆。在高倍镜（×100下对每张切片都任意选择观察5个视野。计数200个细胞/视野，共计1 000个细胞。通过统计阳性细胞个数的比率与染色程度来进行半定量评分。利用统计阳性细胞的个数来达到计分目的：0分表示无着色；1分表示1％～25％；2分表示26％～50％；3分表示51％～75％；4分表示大于75%。结合染色强度来进行评分即：0分即为不着色；1分即为黄色；2分即为棕色；3分即为棕褐色。评分结果：0～1分、2～3分、4～6分以及大于6分相对应结果分别为阴性（－）、弱阳性（＋）、中等阳性（＋＋）、强阳性（＋＋＋）。－～＋为表达缺失、低表达；＋＋＋＋＋为过表达；＋～＋＋＋均为阳性。评分的结果是通过两名有经验的病理医生所标准化的。
1.4 统计学分析
     利用统计软件 SPSS 170来做相关的统计以及分析。应用“行与列表相乘”的2检验、2是确定是否检验正确的、Fisher采取四格表资料来确切概率法，利用Spearman相关去分析CK7与AQP1之间的相互关系，相关系数r表示相关性。当P<005时认定组间比较差异有统计学意义。
     2 结果
2.1 患者的肿瘤组织的AQP1的表达状况和在正常卵巢组织中AQP1的表达状况
     在免疫组化中抗体在细胞浆或细胞膜出现棕褐色或棕黄色颗粒是AQP１阳性表达的体现。AQP1在转移性卵巢癌、原发性卵巢癌、良性上皮性肿瘤、交界性肿瘤和正常卵巢组织中的表达阳性率分别是789%(45/57)、750%(6/8)、667%(7/12)、267%(4/15)和200%(2/10)。这五组数据之间比较差异有统计学意义（2=23,P<005），见表1。

表1 AQP1在几种不同组织中的表达情况

(n,%)

组织来源	例数	AQP1表达情况 － ＋ ＋＋ ＋＋＋ 阳性率2P
正常卵巢	10	8	1	1	0	20.0	23	<0.05
良性肿瘤	15	11	2	2	0	26.7
交界性肿瘤	12	4	1	2	5	66.7
原发性卵巢癌	57	12	13	17	25	78.9
转移性卵巢癌	8	2	1	2	3	75.0

2.2 患者的肿瘤组织的CK7的表达状况和在正常卵巢组织中CK7的表达状况
     CK 7在免疫组化中的阳性染色为表现在细胞浆或细胞膜上面的棕黄色或棕褐色颗粒，它在原发性卵巢癌、转移性卵巢癌、良性上皮性肿瘤、交界性肿瘤和正常卵巢组织中的表达阳性率分别是929%、250%、583%、267%和100%。这五组数据比较差异有统计学意义（2=34,P<005）,见表2。

表2 在几种不同组织中CK7的表达状况

(n,%)

组织来源	例数	CK7表达情况 － ＋ ＋＋ ＋＋＋ 阳性率2P
正常卵巢	10	9	1	0	0	10.0	34	<0.05
良性肿瘤	15	11	4	0	0	26.7
交界性肿瘤	12	5	4	1	2	58.3
原发性卵巢癌	57	4	0	11	42	92.9
转移性卵巢癌	8	6	1	1	0	25.0

2.3 卵巢癌组织中AQP1和CK7表达之间的相互关系
     由CK7在卵巢癌组织中表达为阳性和阴性的病例中可见，AQP1表达为阳性表达的机率分别是831%和250%，两者比较，差异有统计学意义，其中r=0099，2=49，P<005，探究结果提示了卵巢癌组织中AQP1和 CK7成正比例关系,见表3。

表3 卵巢癌组织中AQP1和CK7表达之间的相互关系

类别	例数	AQP1(+)	AQP1(－)	r	2	P
CK7(+)	53	44	9	0.996	4.9	<005
CK7(-)	4	1	3

2.4 免疫组化检测法检测AQP1和CK7在各组织中的表达
     见图1。

 

图1 AQP1和CKT在各组织中的表达
3 讨论
     最近十年之间，初期诊断并治疗卵巢癌在医疗界一直是炙手可热的研究话题。根据探究结果显示，在卵巢癌新生的血管内部皮质细胞或是一些肿瘤癌巢中许多AQP1被表达。而在以上部位被表达的AQP1明显比在卵巢交界性肿瘤中被表达得高很多。这提示了AQP1的高表达性和在表达的部位的肿瘤恶与良性有着密切的关联。在相关的参考文献中说明了AQP1可以引发癌症，认为AQP1全长cDNA的异位表达可以导致很多。在表现方面的更改从而引发了恶性肿瘤［3］。
     FOLKMAN［4］提出了有关于肿瘤血管形成过程方面的假定,也就是在说明形成肿瘤新生的血管的时期明显早于增生肿瘤细胞群的时期。他也提出了生长、浸润以及转移恶性肿瘤都完全依靠着形成与生长新生血管这一过程。许多基本的临床探究也对以上这些说法表示赞同。在大量的肿瘤血管中AQP1被高表达，它是一种由肿瘤新生成的促进性的因子，也标记了血管增生这一过程，它配合生成血管这一过程。在国际相关的医学报道中都认定AQP1可以增加新形成的肿瘤血管的数量，可以促进的侵袭与转移肿瘤这些过程，在各种恶性肿瘤（如：宫颈癌、结直肠癌、肺癌等）都有一定的高表达［5-9］。并且在人体外部的相关探究实验中表明，抑制AQP1的表达可以对侵袭与转移肿瘤细胞这些过程起到一定逆转的作用［10］。提示了AQP1是关系到肿瘤发生与进展的这些过程。
     利用鼠模型探究表明在肿瘤血管内部皮质中AQP1表达的减少与逆转抑制、转移原发肿瘤这些过程有着密切关系。抑制及转移癌灶的减弱相互抑制，也深入提示了AQP1对生长肿瘤与浸润转移肿瘤有一定的作用［11-12］。另外还有一些探究表明在对一些恶性肿瘤（如：胸膜恶性间皮瘤、胆道肿瘤、肾癌等）的预后方面也与AQP1有着密切关联［13-15］。
     细胞角蛋白是一种中间丝蛋白，它是构造细胞基本结构的重要部分。现如今有20种亚型是被人了解的并且在各种脏器的上皮细胞内分布着。一般是在患者上皮细胞上分布，在组织与分化这两个部分都有很好的的特异性。通过分析CK组型，对判定肿瘤细胞是否存在、分化的具体方位或是相关的病理组织的种类以及来源起到一定帮助的作用。CK的一个亚型是CK7（单克隆抗体），它是一种以分子量为54Kda存在着的碱性细胞角蛋白，它提取在人体内部的OTNⅡ卵巢癌株中，CK7在乳腺、肺、子宫内膜和间皮细胞都可以呈现以一种阳性方式表达。所以，进一步说明了CK7特别地标记了鉴定原发性上皮性肿瘤和转移性腺癌这一过程，是其特异性标志物［16］。
     在卵巢上皮癌组织中CK7有着特别高的阳性表达机率，基本上可以达到90%以上，探究出的结果在本阶段的实验中也得到了一定的认可，另一方面本阶段的实验探究中的转移性卵巢癌中的阳性表达机率很小只达到了25%得出的结果与原发性卵巢癌之间相比较其明显的差异是具有统计学意义的，实验探究也提示了CK7是具备严格的上皮组织特异性。
     发生发展和转移肿瘤这一过程是由多个步骤、多个因子以及多种因素共同组成的非常复杂的过程，当细胞内外的各种信号对细胞产生刺激，此时细胞自身的杀伤程序会被激活，这一系列表现是细胞内主动进行自我破坏的过程，被称作细胞凋亡，而当细胞凋亡与细胞增殖之间的平衡关系被打破时就会导致引发患者肿瘤的机率增高。多基因协同作用在对于探究恶性肿瘤之中一直是最受关注的课题。探究的课题也从前者渐渐过渡到恶性肿瘤的发生以及转移，对于生成的肿瘤比如：在初期血管的增生、维持或是在末期时增生血管的延续。在不断探究中使肿瘤血管通透性增加，新产生的肿瘤血管使肿瘤之间血管化，并且影响了肿瘤的生长以及扩散这些过程。通过进一步去探究信号转导通路及血管生成基因调控，增加了相关人士研究抑制肿瘤血管增生以及肿瘤血管形成这些课题，对在临床上治疗肿瘤起到了很大的帮助作用。水通道蛋白可以有效地促使肿瘤血管的增生也使肿瘤血管的通透性增强。细胞角蛋白可以更好地体现出生

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长与转移肿瘤这些过程。两者之间以及两者与恶性肿瘤之间的相互关系已经被医疗界所重视，但是还需要深入去分析出它们之间的作用机理。
     如今许多国内外相关人士通过探究表明了在恶性肿瘤中常常会出现AQP1和CK7过度或者上调表达，通过观察在卵巢癌中的表达阳性率发现它们之间有相同的地方，这是本研究得出的结果，在其他地方还没有得出过相关的探究结果。它们在卵巢癌中的引发发展的影响及两者之间相互关系反映出了在肿瘤发生及变化中的细胞凋亡、肿瘤血管生成这些复杂变化的关系。

参考文献
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