转化生长因子TGF-β1-509(C/T)基因多态性与不明原因复发性自然流产的易感性研究

基金项目：广东省人口和计划生育委员会科研项目（编号：2012270）
黄志强 邱俊杰 张海波 钟柳婵 陈静敏 黄 婕 黄少媛：广州医科大学金域检验学院 广东广州 510182
戚潜辉 陈盛强：广州医科大学附属第二医院 广东广州 510260
通讯作者：陈盛强

转化生长因子TGF-β1-509(C/T)基因多态性与不明原因复发性自然流产的易感性研究

黄志强 邱俊杰 张海波 钟柳婵 陈静敏 黄 婕 黄少媛 戚潜辉 
陈盛强
RESEARCH ON THE CORRELATION BETWEEN GENE POLYMORPHISMS OF TGF-β1-509(C/T) AND UNEXPLAINED RECURRENT SPONTANEOUS ABORTION
HUANG Zhiqiang, QIU Junjie, ZHANG Haibo, et al

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  【摘 要】 目的 探讨转化生长因子TGF-β1-509(C/T)基因多态性与不明原因复发性自然流产的关系。方法 运用PCR-RFLP技术检测59例不明原因复发性自然流产患者(URSA组)及252例正常孕妇(对照组)TGF-β1-509(C/T)基因多态性。结果 URSA组TGF-β1-509 CC,CT,TT三种基因型频率（%）分别为1695、6780、1525；对照组分别为1429、4642、3929。URSA组转化生长因子TGF-β1-509 C、T基因频率（%）分别为5085、4915；对照组分别为3281、6719。URSA组CT基因型频率明显高于对照组（2=8732，P=0003）；而TT基因型频率则明显低于对照组（2=1218，P<0001）。URSA组C等位基因明显高于对照组，T等位基因明显低于对照组（2=13846，P<0001）。结论 转化生长因子TGF-β1-509(C/T)基因多态性与URSA的遗传易感性有关，CT基因型可能为URSA的易感因素之一，TT基因型可能为URSA的保护因素之一。
  【关键词】 不明原因复发性流产,遗传多态性,转化生长因子TGF-β1

  【Abstract】 Objective To explore the relationship between polymorphism of transforming growth factor TGF-β1-509 (C/T) gene and unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA). Method The genotypes of TGF-β1-509 (C/T) gene were determined by PCR-RFLP in 59 patients with Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion and 252 healthy controls. Result The genotype frequencies of TGF-β1-509 (C/T) in URSA group were as follow, TGF-β1-509 CC、CT、TT genotype frequencies (%): 1695、6780、1525; TGF-β1-509 C、TGF-β1-509 T allele frequencies (%): 5085、4915. TGF-β1-509 CC、CT、TT genotype frequencies (%) in control group were as follow: 1429、4642、3929; TGF-β1-509 C、TGF-β1-509 T allele frequencies(%): 3281、6719. TGF-β1-509 CT genotype frequency in URSA group was significantly higher than those in healthy controls (2=8732, P=0003); TGF-β1-509 TT genotype and T allele frequencies in URSA group were significantly lower than those in healthy controls (TT genotype: 2=1218, P<0001; T allele: 2=13846, P<0001). Conclusion The TGF-β1-509 (C/T) gene polymorphism may be related to the susceptibility to URSA. The CT genotype is a risk factor for URSA and the TT genotype is a protective factors for URSA.
     【Key words】 Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion; Genetic Polymorphisms; Transforming growth factor TGF-β1
     【Author′s address】 Golden Mile Inspection Academy, Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, 510182, China
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.12.009 

  复发性流产是指同一性伴侣连续2次或2次以上发生的自然流产，排除染色体异常、解剖异常、内分泌异常、感染等因素，仍有40%~50%的患者原因不明，称为不明原因复发性自然流产（Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion，URSA）。正常妊娠的维持有赖于正常的蜕膜免疫微环境，其中Th1细胞因子与Th2细胞因子的动态平衡就起着重要的作用［1］。正常孕妇体内Th2细胞因子处于优势状态，具有保护胚胎组织的作用。有研究表明，自然流产患者体内Th1/Th2细胞因子的动态平衡被打破，Th1细胞因子表达过度导致流产［2］。转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种Th2因子，具有抑制Th1因子分泌，调节子宫血流，利于胚胎着床，调控胎盘血管形成等作用［3-4］。是维持正常妊娠的一种重要的细胞因子。迄今为止，国内外已有研究报道TGF-β1基因多态性与URSA的相关性，但结果不尽相同。本研究通过PCR-RFLP技术，对比URSA组与对照组，分析TGF-β1-509(C/T)位点的基因多态性与URSA的相关性，为URSA的免疫学研究奠定基础，同时为广东地区URSA患者的诊治提供依据。
     1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 URSA组 URSA患者59例，选自广州医科大学附属第二医院，并经临床诊断为复发性流产。并满足以下条件: 所有患者既往有自然流产史(2～5次)，孕期≤3个月; B 超检查排除女方生殖器官发育异常，妇科内分泌检查正常，抗磷脂抗体、抗甲状腺功能亢进抗体等常见自身抗体阴性，双方染色体正常，男方无精子异常。
1.1.2 对照组 健康妇女252例，选自在广州医科大学附属第二医院进行体检且结果均无异常者。年龄30～40岁，平均330岁，至少有1次正常生育史，无自然流产、死胎、死产史以及其他不良妊娠史;无系统性红斑狼疮及甲状腺功能亢进等自身免疫性疾病病史。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的抽提 知情同意后无菌采集静脉血 3 mL，使用酚-氯仿法进行DNA抽提，-20℃保存备用。
1.2.2 TGF－β1基因的检测 TGF-β1-509(C/T)扩增所用引物［5］ F:5’–CAGACTCTAGAGACTGTCAG-3’, R:5’-GTCACCAGAGAAAGAGGAC-3’，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR体系总体积25 μL，其中包含双蒸水165 μL，10×PCR缓冲液25 μL，2 mmol/LdNTP 1 μL，上下游引物各02 umol/L，TagDNA聚合酶25 U，模板DNA 2 μL。PCR反应的温度与时间条件为：首先94℃预变性5 min，然后按照94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s循环30次，末次循环后于72℃延伸7 mim，最后于4℃保存备用。PCR扩增产物的检测采用15%琼脂糖凝胶在室温下恒压120 V电泳35 min后取出，使用凝胶成像仪记录结果。酶切反应体系总体积15 μL，其中包括PCR产物10 μL，10×酶切缓冲液15 μL，10 U/μL Bsu36Ⅰ内切酶15 μL,双蒸水3 μL，37℃水浴3 h。酶切产物的检测采用30%琼脂糖凝胶在室温下恒压120 V电泳35 min后取出，使用凝胶成像仪记录结果。
1.3 统计学处理
     所有数据均经统计软件 SPSS 190处理， URSA组与对照组各等位基因频率利用两样本的四格表2检验进行统计分析。
     2 结果
2.1 TGF-β1-509(C/T)等位基因的指定
     标本经PCR/RFLP后可产生3种酶切格局：TGF-β1-509 CC野生纯合子无法被Bsu36I内切酶消化，不产生酶切，电泳后只出现419 bp一根条带；TGF-β1-509 TT突变纯合子可被Bsu36I内切酶完全酶切，电泳后出现229 bp和190 bp两根条带；TGF-β1-509 CT突变杂合子只能被Bsu36I内切酶部分酶切，电泳后出现419 bp，229 bp，190 bp三根条带。TGF-β1-509(C/T)基因电泳图谱见图1。

注：Marker 1 000/700/500/400/300/200/100 bp；1,4 泳道 CC 野生纯合基因型（419 bp）；2,5 泳道 TT 突变纯合基因型（229,190 bp）；3,6 泳道 CT 突变杂合基因型（419,229,190 bp）

图1 TGF-β1 基因-509(C/T)位点酶切图(内切酶：Bsu36I)
2.2 URSA组与对照组TGF-β1-509(C/T)基因型与等位基因频率的分布
     TGF-β1-509(C/T)基因CT与TT基因型在两组人群中的分布差异有显著性（CT：2=8732，P=0003;TT：2=1218，P<0001）。CT基因型在URSA组中的分布频率明显高于对照组，TT基因型在URSA组中的分布频率明显低于对照组。C，T等位基因频率在两组人群中也存在显著性差异（2=13846，P<0001）,见表1。

表1 TGF-β1基因多态性与反复自然流产的单因素分析

n(%)

SNP-509	URSA组（n=59）	对照组（n=252）	2	P	OR(95%CI)
基因型
CC	10(16.95)	36(14.29)	0.269	0.604	1.22(0.57~2.62)
TT	9(15.25)	99(39.29)	12.18	<0.001	0.278(0.13~0.59)
CT	40(67.80)	117(46.42)	8.732	0.003	2.43(1.33~4.43)
等位基因
C	60(50.85)	189(32.81)	13.846	<0.001	2.11(1.41~3.15)
T	58(49.15)	387(67.19)			0.47(0.31~0.70)

2.3 群体代表性检验
     URSA组与对照组TGF-β1-509(C/T)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(URSA组：2=3516，P=0172;对照组：2=0021，P=0989)，表明两组研究对象来自同一群体。
     3 讨论
     正常妊娠被视为一种成功的半同种异体移植现象，母体会对胎儿产生免疫耐受，使母体针对胎儿产生保护性免疫应答，进而使胎儿这种同种半异体抗原不会被母体排斥而存活下来；妊娠的失败则可视为母胎免疫耐受被打破。大量研究表明，Th1/Th2细胞因子的动态平衡与妊娠密切相关。Th1细胞因子主要介导炎症反应以及细胞免疫，在妊娠期间具有损伤滋养层，抑制胎盘生长发育，影响胎盘功能的作用。Th2细胞因子主要介导体液免疫和同种排斥反应耐受，在妊娠过程中具有促进子宫胎盘生长，抑制Th1细胞因子对胎盘的损伤等作用［6］。王妍等［7］发现URSA患者母胎界面IL-2和IL-4等Th1细胞因子含量高于正常妊娠妇女。这些结果提示Th1/Th2细胞因子平衡在妊娠免疫耐受中发挥着重要的作用。
     ZENCLUSSEN等学者发现， 经Treg治疗后“流产鼠”蜕膜组织中TGF-β、Ho-1和LIF高水平表达［8］。其中转化生长因子-β1(TGF-β1)作为一种 Th2 型细胞因子，除了具有促进细胞外基质产生，促进间质纤维化，抑制多种细胞增殖分化等作用外，还具有免疫抑制功能，它能抑制巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖分化以及活性 ［9］。在妊娠过程中，TGF-β1具有调节胎盘生长发育，抑制Th1细胞因子的分泌，调节子宫血流，改善子宫内膜容受性，有利于胚胎着床等。此外，TGF-β1还具有抑制Th1细胞因子分泌的作用，妊娠期间若TGF-β1 在体内表达量下降可导致 Thl 细胞因子相对性增加，Th1/Th2细胞因子动态平衡被打破，激活多种毒性细胞损伤子宫胎盘进而引起流产。
     TGF-β1基因位于19q13,含7个外显子和6个内含子,目前已发现的TGF-β1 SNP位点有9个，其中-509位点位于TGF-β1基因上游的启动子区域。国外有报道称TGF-β1-509（C/T）位点的突变影响了启动子与转录因子YY1的亲和力,导致TGFβ1基因转录水平升高,从而参与多种疾病的发生发展过程［10］。
     TGF-β1-509(C/T)基因多态性与URSA的相关性的研究国内外均有报道,结果不尽相同。李霞［11］研究表明TGF-β1-509(C/T)TT基因型和T等位基因在URSA组中的分布频率明显高于对照组。AMANI D ［12］等人研究表明，TGF-β1-509(C/T) 基因多态性与URSA易感性无明显相关。本研究与李霞的研究结果不同，我们发现TGF-β1-509(C/T)的CT基因型在URSA组中的分布频率明显高于对照组，差异具有统计学意义，说明携带CT基因型的女性发生反复自然流产的风险增大，表明TGF-β1-509(C/T)的CT基因型与URSA的发生有关，该基因型可能是反复自然流产的易感基因型。同时我们还发现，TGF-β1-509(C/T)的TT基因型与T等位基因在URSA组中的分布频率明显低于对照组，差异具有统计学意义，表明TGF-β1-509(C/T)的TT基因型可能为URSA的一个保护因素。李霞的报道是针对宁夏人群；AMANI D的研究则是针对伊朗南部人群；而本实验是针对广东人群，种族差异可能是引起结果不同的原因。另外还可能与样本的选择，数量以及地域等因素有关，使不同人群TGF-β1基因多态性与URSA相关性存在着差异，这方面还有待进一步研究。

参考文献
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