内皮素-3基因启动子甲基化及其表达在乳腺癌中的临床意义

基金项目：广州市医药卫生科技项目（编号：20131A011187）
洪晓绿 潘小平 徐沛演：广州市花都区人民医院 广东广州 510800
通讯作者：潘小平

内皮素-3基因启动子甲基化及其表达在乳腺癌中的临床意义

洪晓绿 潘小平 徐沛演
CLINICAL SIGNIFICANCE OF THE MRNA EXPRESSION AND INCIDENCE RATE OF METHYLATION OF ENDOTHELIN-3 PROMOTER IN PATIENTS WITH BREAST CANCER
HONG Xiaolv, PAN Xiaoping, XU Peiyan

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  【摘 要】 目的 检测内皮素-3（EDN-3）基因启动子甲基化及其表达在乳腺癌组织中的变化，并分析其临床意义。方法 采用甲基化特异PCR（MS-PCR）和实时定量PCR（RT-PCR）方法检测42例乳腺癌组织（实验组）及50例正常乳腺组织（对照组）EDN-3基因启动子甲基化发生率及其mRNA表达，比较以上两指标变化在乳腺癌各临床参数之间的统计学差异。结果 实验组EDN-3启动子甲基化检出率为6429%（27/42），对照组EDN-3启动子甲基化检出率为800%（4/50），差异有统计学意义（  2=4217, P<001），该检出率在患者不同年龄，不同肿瘤组织类型和大小，有否区域淋巴结转移及远处转移之间差异均无统计学意义（P>005）。实验组EDN-3 mRNA表达较对照组显著降低，差异有统计学意义（t=-821，P<001），但这种降低在上述不同临床参数之间差异亦无统计学意义（P>005）。结论 EDN-3基因异常甲基化与乳腺癌密切相关，它能影响其mNRA转录水平，对其进行检测能为乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助。
  【关键词】 内皮素-3基因,乳腺癌,甲基化特异PCR

  【Abstract】 Objective To investigate the mRNA expression and methylation of endothelin-3 (EDN-3) promoter in patients with breast cancer and to evaluate the clinical significance. Methods The methylation rates and mRNA expressions of EDN-3 gene in 54 patients with breast cancer (experimental group) and 60 healthy women (control group) were assessed with methylation-specific polymerase chain reaction (MS-PCR) and, real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) respectively. Statistical differences of the two index changes in the clinical parameters of breast cancer were compared. Results The detection rate of methylation of EDN-3 promoter was 55.56% (30/54) in experimental group and 8.00%(4/5) in the control group, there were significant differences between those two groups (2=4217, P<001). However there were no statistical differences in terms of the age, tumor size and type, regional lymph node metastasis and distant metastasis (P>005). There were significant differences between the two groups in terms of the expression of endothelin-3 mRNA which significantly decreased in breast cancer patients compared to that of healthy women (t=-8.21, P<001). But there were no statistical differences among all the clinical parameters(P>005). Conclusion Abnormal methylation of EDN-3 promoter is closely correlated to the occurrence and development of breast cancer and could down-regulate the transcription of mRNA of EDN-3, thus providing biomarker for early diagnosis and prognosis of breast cancer. 
     【Key words】  Breast cancer, Endothelin-3, Real-time quantitative PCR, Methylation-specific PCR
     【Author′s address】 People′s hospital of huadu district, Guangzhou, Guangdong, 510800 PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.11.007 

  乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,全球每年约有120 万女性罹患乳腺癌,且其发病率以每年2%的速度递增［1］，严重危害女性身心健康。乳腺癌的发生与多种因素有关,发病机制呈现多元化,包括基因因素和非基因因素［2］,某些基因如内皮素(Endothelin,EDN)基因中EDN-1、EDN-2 水平变化可能是乳腺癌发生的分子机制［3］,但EDN-3 在乳腺癌的变化情况及其与患者临床病理状态的关系少见报道。在前期研究中我们证实EDN-3 mRNA在乳腺癌患者外周血中的表达量显著减少［4］，现本文研究其减少的原因。我们利用甲基化特异性PCR（MS-PCR）方法检测EDN-3基因启动子的甲基化情况，同时采用实时定量PCR（RT-PCR）检测乳腺癌组织中EDN-3 mRNA的表达量情况，探讨该表达量的变化是否与乳腺癌患者外周血中的表达量变化相一致。
     1 材料与方法
1.1 一般材料
     选取2013-01-01~2014-10-30在本院接受乳腺手术且经病理学证实为乳腺癌的癌组织42例作为本研究的实验组，年龄33～69岁，平均（514±112）岁，其中>50岁22例，≤50岁20例。乳腺癌分类参照WHO 2003标准［5］，其中肿瘤大小T1 27例，T2~4 15例；组织学分型导管型24例，小叶型18例；无淋巴结转移（N0）26例，淋巴结转移（N1~3）16例；无远处转移（M0）27例，远处转移（M1）17例。另选同期在我院接收乳腺手术（包括乳腺炎；乳腺囊性增生病；乳腺纤维瘤；乳腺管内或囊内乳头状瘤）且经病理学证实为非乳腺癌的乳腺组织50例作为对照组，年龄23～58岁，平均（389±123）岁，两组间年龄差异不具有统计学意义（t=0821,P=0626），具有可比性，所有组织经手术切除后置于-80 ℃保存备用。
1.2 主要仪器及试剂
     普通PCR仪（C1000 Thermal cycler，BIO-RAD），荧光定量PCR仪（7300，ABI），制冷机（AF100，Scotsman），凝胶成像系统（Transilluminator M-26，UVP）。Trizol ［Invitrogen(9109)］，DEPC（Sigma），PrimeScriptTMRT逆转录试剂盒（TaKaRa），SYBR RT-PCR试剂盒（TaKaRa），DNA 提取试剂盒（广州，捷倍斯），甲基化试剂盒（Active Motif）。
1.3 引物设计与合成
     采用Methyl Primer express V10 软件设计EDN-3甲基化（EDN3-M）和EDN-3非甲基化（EDN3-U）引物，所有序列均在ABI 3900台式高通量DNA合成仪（Invitrogen公司）上合成。各种引物序列见表1。

表1 实验所用引物序列

	Sequence (5′3′)	T/℃	Cycles	products/bp
EDN3-U	Forward:TTTGGGAGGTGATTTTTAGTGTGTTT	60	40	144
	Reverse: ACCCATCCCTACACAAAACTAACCA
EDN3-M	Forward: TGGGAGGCGATTTTTAGTGCGTTC	60	40	140
	Reverse: CCATCCCTACGCGAAACTAACCG

1.4 DNA提取及甲基化修饰
     各取10g左右实验组及对照组组织，按照DNA 提取试剂说明书提取组织中总DNA，随后采用Wash Buffer连续洗涤2次，提纯DNA，取1 μL DNA样品50倍稀释，在紫外分光光度仪上测定A(260)/A(280)值为18~20，纯度较高。每例DNA标本取1 μg按照甲基化试剂盒说明书进行修饰，经修饰后的DNA中，未甲基化的胞嘧啶（C）被氧化性脱氨基后变成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶不变。-80 ℃保存备用。
1.5 MS-PCR
     配制30 μL MS-PCR反应体系，其中DNA 4 μL，dNTPS 05 μL,Taq酶 02 μL，10×PCR buffer 3 μL，Forward primer (10 pmol/μL) 15 μL，Reverse Primer (10 pmol/μL) 15 μL，H2O 193 μL。反应条件为：93 ℃ 5 min；然后93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40循环；72 ℃ 7 min。取产物10 μL，2％琼脂糖凝胶电泳120 V×40 min，凝胶成像系统观察结果。
1.6 RT-PCR 
     使用Trizol 试剂分别提取实验组及对照组组织中总RNA，随后采用RNase-free的DNase Ⅰ（Promega）试剂将总RNA提纯。按照本实验室建立的反应体系及扩增条件进行RT-PCR［6］，检测实验组及对照组组织中EDN-3 mRNA的表达。
1.7 统计学处理
     计量资料采用均值±标准差（±s）表示，均经正态性检验和方差齐性检验，计量资料之间的比较采用t检验，计数资料比较采用卡方检验，检验水准α=005。采用SPSS 130进行统计分析。
2 结果
2.1 实验组与对照组END-3启动子甲基化检出率之间的比较
     MS-PCR结果包括甲基化、未甲基化和部分甲基化三种（见图1），部分甲基化病例归为甲基化进行统计。实验组中检测出甲基化20例，部分甲基化7例，未甲基化15例，总甲基化检出率为6429%（27/42），而对照组中检出部分甲基化4例，未甲基化46例，总甲基化检出率为800%（4/50），两组甲基化检出率差异具有统计学意义（  2＝4217，P<001）。这种高EDN-3启动子甲基化检出率在患者临床病理状态，包括患者年龄、肿瘤组织类型和大小、有否区域淋巴结转移及远处转移之间比较差异均无统计学意义（P>005，见表2）。
2.2 乳腺癌组织中EDN-3 mRNA的表达及临床各参数之间的比较
     结果显示，实验组EDN-3 mRNA的表达量（（5712±1316）×103 copies/μL）较对照组（（45231±25379）×103 copies/μL）明显降低，差异具有统计学意义（t=-821，P<001）。但这种降低在不同临床参数，包括患者年龄、肿瘤组织类型和大小、有否区域淋巴结转移及远处转移之间比较差异均无统计学意义（P>005，见表3）。

注：1为甲基化内参；2为非甲基化内参；3、4为完全甲基化样本；5、6为部分甲基化样本；7、8为完全未甲基化样本；9、10为无菌双蒸水;M:甲基化引物MS-PCR后电泳条带；U：非甲基化引物MS-PCR后电泳条带

图1 MS-PCR检测结果电泳图

表2 不同临床参数乳腺癌患者EDN-3
启动子甲基化检出率比较

n（%）

临床参数	总例数	甲基化	 2	P
年龄/岁
≤50	20	13（65.00）	3.524	0.318
>50	22	14（63.64）
组织类型
导管型	24	16（66.67）	4.667	0.198
小叶型	18	11（61.11）
肿瘤大小
T1	27	19（70.37）	5.571	0.062
T2~4	15	8（53.33）
区域淋巴结转移
N0	26	16（61.54）	5.81	0.121
N1-3	16	11（68.75）
远处转移
M0	27	18（66.67）	4.545	0.103
M1	17	9（52.94）

表3 乳腺癌患者不同临床参数间EDN-3 mRNA
表达比较

×103copies/ μL, （±s）

临床参数	总例数	EDN-3 mRNA	t	P
年龄（岁）
≤50	20	6.032±1.625	3.152	0.131
>50	22	5.161±1.412
组织类型
导管型	14	5.855±1.153	1.367	0.622
小叶型	18	5.379±1.427
肿瘤大小
T1	27	5.659±1.637	1.104	0.811
T2～4	15	5.733±1.688
有否区域淋巴结转移
N0	26	5.914±2.103	1.742	0.267
N1～3	16	5.263±1.562
远处转移
M0	27	5.857±1.963	2.965	0.094
M1	17	4.688±1.742

3 讨论
     EDN-3是EDN家族（EDN-1，EDN-2，EDN-3）成员之一，通过自分泌和旁分泌的方式与细胞表面的EDN-A (EDNRA) 和EDN-B (EDNRB)受体相互作用［7］，参与细胞的生物功能，如细胞的增殖、分化以及诱导细胞转移等［8］。我们的研究证实，EDN-3与乳腺癌的发生密切相关［4］。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，是由 DNA 甲基转移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化S-腺苷蛋氨酸上的甲基转移至胞嘧啶含氮杂环5 ′位上的修饰反应［9］，与肿瘤的发生发展相关［10］。DNA甲基化在肿瘤基因表达调控、细胞增殖分化等方面起着重要的作用，并与肿瘤的发生密切相关，已证实DNA甲基化与许多肿瘤和疾病有关，如前列腺癌［11］、胃癌［12］、肝细胞癌［13］、2型糖尿病［14］等。DNA的甲基化可作为某些疾病的诊断依据［15］。
     乳腺癌的发生与许多基因的甲基化有关［16］，在我们的研究中证实乳腺癌患者外周血中存在EDN-3 基因异常甲基化情况［6］，在本研究中，42例乳腺组织中检测出27例EDN-3基因的甲基化，甲基化检出率为64.29%（27/40），显著高于正常乳腺组织EDN-3 基因的甲基化检出率（8%（4/50）），进一步证实无论在乳腺癌患者的乳腺组织中还是在乳腺癌患者外周血中均存在EDN-3 基因的甲基化情况，这些均与乳腺癌的发生密切相关。WIESMANN F等［17］证实EDN-3启动子甲基化是乳腺癌患者预后不良的独立因素，故早期检测乳腺癌组织或外周血中EDN-3基因的甲基化状况，可为乳腺癌的监测和早期诊断提供依据。MIYAHARA ［18］证实大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5′端的非编码区，并成簇存在，因此，在本研究中也能在50例正常乳腺组织中检测出4例EDN-3 基因的部分甲基化，甲基化检出率为8%（4/50），但这种部分甲基化的DNA并不影响其转录水平。
     实时定量PCR结果显示实验组EDN-3 mRNA的表达量较对照组明显降低，差异具有统计学意义（t=-821，P<001）。提示，EDN-3基因异常甲基化，导致EDN-3基因的失活，从而阻断了EDN-3基因的正常转录，该结论与EDN-3基因在乳腺癌外周血中的表达关系一致。
     综上所述，EDN-3基因异常甲基化可能影响其mRNA转录的转录水平，EDN-3基因启动子的甲基化可能参与乳腺癌的发生，临床上对其进行甲基化检测有助于乳腺癌的早期诊断和预后判断，可能为乳腺癌的诊断和治疗开辟新的途径。

参考文献
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