注:1A ERβ阳性( En Vision 二步法 ×200);1B ERβ阴性( En Vision 二步法 ×200)
图1 ERβ在TNBC中的表达
1.2.2 pEGFP-C1/ERβ真核表达载体的构建 以Trizol试剂法提取ERβ阳性表达的人乳腺癌细胞株MCF-7总RNA。以总RNA为模板, Oligo(dT)为引物,将mRNA反转录为cDNA,利用ERβ引物(分别引入限制性内切酶BamH I和Hind III酶切位点)扩增出ERβ序列。上游引物5′-GATGCTTTGGTTTGGGTGAT-3′,下游引物5′-CTTGTTACTCGCATGCCT-3′。以限制性内切酶BamH I和Hind III消化PCR产物, DNA回收试剂盒回收目的片段,将ERβDNA片段插入经相同限制性内切酶消化、回收的真核表达载体pEGFP-C1。连接产物转化E.coli DH5α扩增后,提取细菌中的质粒,酶切鉴定后送华大基因公司测序。成功构建真核表达载体pEGFP-C1-ERβ。
1.2.3 pEGFP-C1/ERβ质粒转染、筛选及鉴定 取对数生长期人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s以2×105个/孔接种于6孔板,以正常MDA-MB-435s细胞为对照, 按Lipofectamine2000TM操作说明书,分别转染pEGFP-C1 (空质粒)和pEGFP-C1-ERβ。 4~6 h后, 弃去转染液,更换2 mL含10%胎牛血清的培养液继续培养。48 h后以750 mg/L的G418的培养液进行筛选, 约16 d后对照MDA-MB-435s细胞全部死亡, 转染组改用200 mg/L的G418的培养液, 将阳性克隆扩大培养后, 建立稳定传代的转染细胞系。
1.2.4 Western-blotting法鉴定ERβ在转染细胞中的表达 收集MDA-MB-435s-pEGFP-C1-ERβ细胞蛋白,将 50 μg 样本加在 8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶孔中, 80 V电压电泳跑胶,110 mA 电流转膜。转膜后用脱脂奶粉封闭 2 h(室温),洗膜后加入ERβ单克隆抗体(1∶ 300)和β-actin(1∶ 500),4 ℃条件下孵育过夜,复温并洗涤后二抗孵育1 h(室温),用化学发光试剂盒Thermo进行曝光,电泳凝胶成像分析仪采集图像。
1.2.5 MTT法检测细胞活性 将MDA-MB-435s、MDA-MB-435s-pEGFP-C1、MDA-MB-435s-pEGFP-C1-ERβ细胞以2×104个/孔的密度接种于96 孔板中,在恒温37 ℃、饱和湿度、5%CO2的条件下培养,设5个平行孔。分别于第1~7天加入100 μL 5 mg/mL甲基噻唑基四唑(MTT) 工作液,孵育4 h后弃去上清,加入100 μL二甲基亚砜( DMSO)溶解MTT还原物,震荡15 min,用酶联免疫仪检测波长为490 nm处的吸光度数值,实验重复3次,取均值。以时间为横坐标,A490值为纵坐标,绘制曲线,评估细胞增殖情况。
1.3 Transwell侵袭实验
在Transwell 小室上室面加入50 μL按比例混合的Matrigel 与DMEM培养基,置于37 ℃凝固。取对数生长期的MDA-MB-435s-pEGFP-C1和MDA-MB-435s-pEGFP-C1-ERβ细胞计数后,加入含5%胎牛血清的DMEM培养基,配成2×105 /mL的细胞悬液,上室每孔加入100 μL细胞悬液,下室加入含10%胎牛血清的培养基。37 ℃培养箱中孵育24 h,取出小室,用棉签拭去Matrigel 胶。95%甲醇室温下固定20 min,风干,0.25%结晶紫染色,风干后,置于显微镜下计数并拍照。
1.4 软琼脂集落形成实验
按1∶ 1比例将0.7% 琼脂与2×DMEM培养液按混合, 加入对数生长期的MDA-MB-435s-pEGFP-C1和MDA-MB-435s-pEGFP-C1-ERβ细胞悬液, 充分混匀,制成密度为2×103/mL的混悬液, 每孔1 mL注入到含0.6%琼脂的六孔板中, 琼脂凝固后, 将六孔板置于恒温37 ℃、饱和湿度、含5%CO2的细胞培养箱中, 培养2 w。用0. 2% 的p-iodonitrotetrazolium violet染色后置于显微镜下观察集落形成并拍照。
2 结果
2.1 ERβ在TNBC患者肿瘤及癌旁组织中的表达
60例TNBC组织标本中, ERβ阳性表达的为23例(38.33%),对应60例癌旁组织中ERβ阳性表达的为31例(51.67%),显著高于癌组织中的阳性表达率。
2.2 稳定高表达ERβ细胞株的筛选及鉴定
用脂质体的方法转染ERβ至人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s中, 经G418筛选, 并通过Western blotting进行鉴定。以亲代细胞MDA-MB-435s和转染空载体的细胞MDA-MB-435s-pEGFP-C1作为对照。获得ERβ蛋白高表达克隆,见图2。
图2 稳定转染ERβ基因的MDA-MB-435s 细胞中ERβ表达量增高
2.3 ERβ抑制TNBC细胞的生长
通过MTT法绘制三组细胞生长曲线以观察ERβ对细胞增殖的影响。与MDA-MB-435s细胞及转染空质粒的细胞MDA-MB-435s-pEGFP-C1相比,转染ERβ的MDA-MB-435s细胞其生长速度下降,见图3。
2.4 ERβ对TNBC细胞侵袭能力的影响
通过计数穿过微孔膜的细胞数量来衡量细胞的侵袭能力。与转染空载体的细胞相比, 转染ERβ的MDA-MB-435s细胞穿过transwell微孔膜的细胞数量明显下降,细胞的侵袭能力明显降低,见图4。
图3 ERβ的表达对MDA-MB-435s细胞增殖能力的影响
图4 ERβ的表达对MDA-MB-435s细胞侵袭能力的影响
2.5 ERβ对TNBC细胞成瘤能力的影响
软琼脂集落形成实验显示, 与转染空载体的细胞相比, 转染ERβ的MDA-MB-435s细胞形成的集落明显减少,说明ERβ可抑制TNBC细胞的锚定非依赖性生长能力。
3 讨论
TNBC好发于30~40岁的绝经前妇女、体质量指数较高的绝经前妇女、腰臀比较高的围绝经期女性,以及有乳癌家族史或BRCA1基因突变失活的女性[6-8]。TNBC的治疗目前仍主要依靠化疗,由于大多数TNBC 存在BRCA1基因的突变,而体外研究证实铂类药物、丝裂霉素、依托泊苷和博来霉素等对BRCA1 基因突变的乳腺癌敏感[9],所以有学者认为大剂量化疗能给TNBC患者带来更大的生存获益[10]。在分子靶向治疗方面,现有的研究发现PARP(一种DNA 修复酶)可能是TNBC新的治疗靶点,而其它靶向药物如贝伐单抗(Bevacizumab, Avastin)西妥昔单抗(Cetuximab)等仅有小范围的临床试验[11-12]结果并不令人满意。现在针对TNBC的化疗药物和靶向治疗药物还无法在大样本、前瞻性、多中心临床试验中得到验证,同时还存在着副作用大或价格昂贵等缺点,因此,寻找潜在有效的治疗靶点,解决TNBC治疗效果不佳的难点,具有重要的意义。
人类ERβ基因位于染色体14q23-24.1,由530个氨基酸构成[13]。ERα和ERβ通常在大多数正常乳腺组织、乳腺癌和乳腺癌细胞株中共同表达,但某些乳腺癌细胞只表达ERβ,也有乳腺癌细胞两种受体都不表达[14]。ERβ在许多ERα阴性和TNBC细胞中表达,提示ERβ在雌激素信号通路和三阴乳腺癌的发病机制中发挥作用。但是其表达水平的高低对TNBC细胞增殖和凋亡的影响还没有定论,与相关生理病理指标的关系以及它在临床内分泌治疗中的地位还有很多不一致的结果。在非乳腺癌肿瘤中的研究发现ERβ是一个重要的抑癌因子,在肿瘤细胞中表达明显减少[15]。ER除了通过与雌激素结合这种配体依赖性的方式调节转录翻译外,还可以在无雌激素作用时以配体非依赖性方式调节转录翻译[16]。在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中也观察到ERβ以雌激素非依赖的方式抑制肿瘤细胞增殖或诱导凋亡[17-19]。可见应用各种ERβ受体激动剂或小干拢RNA来研究ERβ受体的作用,明确它所涉及的有关下游机制,在治疗TNBC的研究中具有很大的价值。
本研究采用免疫组化法检测ERβ在TNBC及癌旁组织中的表达情况,并分析其在两种组织中的表达差异,以及ERβ高表达对TNBC细胞的增殖、侵袭、锚定非依赖性生长能力的影响,研究表明,ERβ过表达后,TNBC细胞MDA-MB-435s的增殖能力明显下降,同时,穿膜能力和锚定非依赖性生长能力均大幅度下降。以上研究结果表明, ERβ的高表达可对TNBC细胞增殖、侵袭及迁移起到抑制作用,在TNBC的发生发展中发挥着重要的作用,为TNBC的基因治疗提供了可靠的实验依据。
综上所述, ERβ的表达与TNBC的发生发展密切相关,其表达缺失可能是TNBC癌变过程中的早期事件。随着对其功能研究的进一步完善,ERβ必将成为诊断和预测TNBC预后的分子标志物和抗TNBC侵袭和转移的生物治疗新靶点,为TNBC的治疗提供新的突破口。
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评价视角上,局部关注得较多,整体关注少。在对医学大学生以及在岗医务人员人文素质评价研究的方面,大多数文献都是对某所大学、某几家地方医院进行评价,没有对影响医学生以及在岗医务人员的综合素质的因素等问题进行深入的分析;②在评价方法上,多数研究运用的方法仍然较单一,不能克服其在评价中的某些缺陷,存在局限性,少有研究应用不同评价方法综合评价;③在评价内容上,缺乏创新发展性人文素质的评价,现有文献研究的评价内容远不能满足当代医学生评价的要求,医学生人文素质的评价内容应针对素质、能力、个性培养;④在选取评价指标上,多数文献采用专家咨询的方式,凭经验较多,缺乏支持指标数据之间的相关性的研究证据;各指标权重分配的主观性、随意性比较大,缺乏规范性和科学性。
综上,医学生人文素质的评价过程是漫长而复杂的,开展人文素质评价方法研究的当务之急就是研究医学生人文素质教育评价理论依据,明确人文素质内涵,规范评价标准,建立可操作性的医学生人文素质评价体系,促进当前医学院校、医疗单位尽早形成规范的人文素质评价机制。
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