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右美托咪啶和丙泊酚对中性粒细胞活性氧释放及细胞凋亡的影响

【】2016-07-07 点击次数
基金项目:江西省卫生厅科技计划项目(编号:20123055)
陈受琳 陈 勇 华福洲:南昌大学第二附属医院 江西南昌 330006
吴清华:南昌大学第二附属医院 江西南昌 330006

右美托咪啶和丙泊酚对中性粒细胞活性氧释放及细胞凋亡的影响

陈受琳 陈 勇 华福洲 吴清华
EFFECT OF THE RIGHT DEXMEDETOMIDINE AND PROPOFOL ON NEUTROPHILS RELEASE REACTIVE OXYGEN SPECIES AND APOPTOSIS
CHEN Shoulin, CHEN Yong, HUA Fuzhou, et al


  【摘 要】 目的 探讨不同浓度右美托咪啶和丙泊酚对中性粒细胞(PMN)受刺激后活性氧释放及对 PMN 凋亡率的干预作用。方法 采集5份健康成人外周静脉血,每份血样均用于下列各组:对照组(C组),右美托咪啶1、2、3 组(D1、D2、D3 组),终浓度分别为05、5、50 ng/ml,丙泊酚1、2、3 组(P1、P2、P3 组),终浓度分别为5、50、500 μg/ml,分别加入 DHR 标记,脂多糖刺激后,流式细胞仪检测 PMN 活性氧的释放和 PMN 凋亡率。结果 右美托咪啶、丙泊酚均剂量依赖性地抑制脂多糖刺激后的 PMN 活性氧的释放,除P1组外其余各组活性氧释放均低于C组(p<005),右美托咪啶的抑制效应强于相应浓度的丙泊酚(p<005);右美托咪啶有抑制细胞凋亡的作用(p<005),而丙泊酚没有(p>005)。结论 右美托咪啶与丙泊酚均有抗氧化和抑制细胞凋亡的作用。
  【关键词】 右美托咪啶,丙泊酚,中性粒细胞,活性氧,凋亡

  【Abstract】 Objective To investigate the role of active oxygen release after the intervention of different concentrations Right dexmedetomidine and propofol on neutrophils (PMN) stimulated and apoptosis rate of PMN. Methods We collected five healthy adult peripheral venous blood, each sample for each of the following: The control group (group C), the right beauty mi organism 1, 2, 3 groups (D1, D2 and D3 group), Final concentration of 0.5, 5, 50 ng/m1, Propofol group 1, 2, 3 (P1, P2, P3), Final concentration respectively of 5, 50, 500 μg/ml, which were put a marker on DHR respectively. Cells after lipopolysaccharide stimulation were detected with PMN release of reactive oxygen species and PMN apoptosis rate. Results Right dexmedetomidine and propofol were dose to suppress lipopolysaccharide stimulation of PMN release of reactive oxygen species. Besides P1 group groups active oxygen release were lower than that of group C (p<005), Right dexmedetomidine had more inhibitory effect than the corresponding concentrations of propofol (p<005); Right dexmedetomidine could inhibit cell apoptosis (p<005), and propofol could not (p>005). Conclusion Right dexmedetomidine and the propofol has antioxidant and inhibiting apoptosis.
     【Key words】  Dexmedetomidine, Propofol, Neutrophils, Reactive oxygen species, Apoptosis
     【Author′s address】 The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang, Jiangxi, 330006, China
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.10.005

  炎症反应过程中,中性粒细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN) 是机体非特异免疫中最重要的效应细胞[1]。中性粒细胞激活后通过呼吸爆发,释放活性氧 (reactive oxygen species,ROS)来防御外来病原体入侵,细胞凋亡是机体适应炎性反应的调控过程。免疫功能低下的群体,较多地存在于全身情况差的手术病人及ICU病人,右美托咪啶和丙泊酚,是手术术中及术后ICU病人长期镇静最常使用的麻醉药物[2]。本实验将研究这两种麻醉药对 PMN 释放 ROS 及对细胞凋亡的干预作用。
     1 资料与方法
1.1 材料与方法
     主要试剂与仪器: 二氢罗丹明123(dihydrorhodamine 123, DRH)、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetae, PMA)、右美托咪啶(dexmedetomidine;批号 H20090248)、丙泊酚(propofol, AstraZeneca, 批号:H20130504)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、Arial III+Calibur 流式细胞仪、SC-2556 型离心机等。
1.2 方法
1.2.1 研究分组 分为空白对照组(C),右美托咪啶组(D),丙泊酚组(P)。其中D组分为D1、D2、D3 三个亚组(终浓度分别为05、5、50 ng/ml),P组分为P1、P2、P3三个亚组(终浓度分别为5、50、500 μg/ml)。分别相当于二者临床麻醉时血药浓度的1、10和100倍[3-4]。
1.2.2 标本采集 健康志愿者8名,年龄20~40岁,体重55~75 kg,无吸烟史,无感染及免疫系统疾病、近2周内未服用影响免疫功能的药物。以肝素化试管抽取空腹肘静脉血20 ml。
1.2.3 技术方法 测定PMN的ROS释放。实验方法参考文献[5],各试管中均加入抗凝全血100ul/管,再分别加入右美托咪啶、丙泊酚,使其终浓度达到各自预定值。C组试管加等体积PBS(001 M,pH 72),均作复管。37 ℃水浴箱孵育30分钟后加入DHR(终浓度15 nmol/L),孵育10 min,加PMA(终浓度015 umol/L),孵育20 min。加入红细胞裂解液2 ml,裂解RBC,混匀,避光室温下静置20 min,3 000 rpm离心5 min,弃上清液并加入含1%多聚甲醛的PBS (001 M,pH 72) 05 ml悬浮细胞,混匀,3 000 rpm再次离心5 min,弃上清液加入PBS重悬浮。阴性对照管调零,流式细胞仪上单通道检测平均荧光强度(激发波长488 nm,发射波长530 nm),取复管的均值作为ROS强度的测定值。
1.2.4 检测PMN凋亡 每组取重悬的细胞悬液100 μl, 加入Annexin V-FITC 5 μl 和碘化丙锭溶液10 μl, 混匀室温避光孵育15 min,加入PBS 重悬细胞溶液300 μl。流式细胞仪上检测平均荧光强度(激发波长488 nm,发射波长530 nm),通过观测细胞变化及亚二倍体峰出现确定细胞凋亡百分比。
1.3 统计分析
     采用SPSS 180 统计软件,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用秩和检验,p<005 认为差异有统计学意义。
     2 结果
2.1 对PMN释放ROS的影响 与C组相比,P1 组无统计学差异,其余各组均显著低于对照组(p<005);与P组相比,D1、D2、D3组显著低于相当药物浓度的P1、P2、P3组(p<005)。提示两者均剂量依赖性地抑制PMA 刺激后PMN ROS的释放。临床浓度的右美托咪啶对PMN OS释放有抑制作用,而丙泊酚对PMN ROS释放影响轻微;在相当的药物浓度时,右美托咪啶抑制作用强于丙泊酚。提示两种药物干预后,均明显减弱中性粒细胞的呼吸爆发功能,右美托咪啶的作用强于丙泊酚。 
2.2 对PMN凋亡率的影响 与C组相比,D组内各组均显著低于C组,P组内P3与C组差异显著,其余两组不明显;与P组相比,D组内D1、D2组显著低于相当药物浓度的P1、P2组(p<005),D3组与P3组差异不显著。提示不同浓度的右美托咪啶均降低细胞凋亡率,高浓度的丙泊酚也有降低细胞凋亡率的作用。
 表1 各组样本对PMA 刺激后PMN 功能比较

(n=10,±s)

组别 浓度(ng/ml) 平均荧光强度 凋亡率(%)
对照组 —— 890.3±15.6 52%±9%
D组 D1:0.5 701.5±50.21)2) 38±61)2)
  D2:5 465.1±55.81)2) 26±121)2)
  D3:50 304.9±14.11)2) 24±61)
P组 P1:5 878.5±51.2 50±11
  P2:50 610.6±62.21) 47±8
  P3:500 568.4±55.21) 27±71)
 与空白组比较,1)p<005;与丙泊酚组比较,2)p<005
3 讨论
     当PMN在吞噬异物或受刺激活化时,产生大量的 ROS ,ROS 具有很高的反应性,可以与细菌的细胞膜、核酸分子及蛋白质发生氧化还原反应,造成微生物的损伤和死亡[6]。此外,ROS 还可上调一些细胞因子及粘附分子如TNF-a、IL-1、ICAM-1的表达水平[7],放大炎症效应,这一过程又称呼吸爆发。ROS 的释放能促进病原微生物的清除、促进伤口愈合。但在某些病理条件下,如严重创伤、烧伤、感染,ROS 的过度释放是导致全身炎症反应综合征、多器官功能障碍的重要原因[8],抑制 ROS 的释放有助于控制炎症。此外,ROS 正常发挥其功能与 PMN 的正常细胞凋亡密切相关。创伤、感染条件下,PMN的凋亡延迟,延长了PMN的作用时间,增加了ROS的释放。
     丙泊酚是临床上使用最广泛的经典静脉麻醉药。而右美托咪啶是新型高选择性α2肾上腺素能受体激动剂[9],具有镇静催眠、镇痛、抑制交感活性等作用,有取代丙泊酚或减少丙泊酚用量的趋势。两者均是术中及术后ICU病人最常使用的镇静药物。本研究显示:右美托咪啶和丙泊酚均明显减弱中性粒细胞的呼吸爆发功能,具有抗氧化的作用。不同浓度的右美托咪啶及高浓度的丙泊酚有抑制PMN凋亡的作用,这在控制全身过度炎症反应上是非常有意义的。有报道显示丙泊酚的抗炎作用可能与白介素6有关[10],而右美托咪啶的抗炎作用机制尚需进一步研究。在本次研究中,通过选取5份健康成人并采集其外周静脉血,其中对照组(C组),右美托咪啶1、2、3 组(D1、D2、D3 组),终浓度分别为05、5、50 ng/ml,丙泊酚1、2、3 组(P1、P2、P3 组),终浓度分别为5、50、500 μg/ml,分别加入 DHR 标记。经分析可知,提示两种药物干预后,均明显减弱中性粒细胞的呼吸爆发功能,右美

(下转第20页)(上接第17页)
托咪啶的作用强于丙泊酚。由此可见右美托咪定可对中性粒细胞呼吸爆发功能发挥更为有效的抑制作用。研究结果同时显示,与C组相比,D组内各组均显著低于C组,P组内P3与C组差异显著,其余两组不明显;与P组相比,D组内D1、D2组显著低于相当药物浓度的P1、P2组(p<005),从这一结果可以看出,不同浓度的右美托咪啶均降低细胞凋亡率,高浓度的丙泊酚也有降低细胞凋亡率的作用。
     综上所述, 右美托咪啶和高浓度的丙泊酚具有抑制 ROS 释放,抗氧化的作用和抑制 PMN 凋亡的作用,研究麻醉药物对PMN激活后的干预作用有助于指导合理的麻醉用药,改善术后感染的发生率。

参考文献
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