中国结核杆菌利福平耐药株rpoB基因531、526、516位点碱基突变特点

基金项目：广东省科技计划项目(编号：2011B318800377,2013B021800060)
曹翌明 孟繁荣 刘志辉：广州市胸科医院 广东广州510095
李 丽：茂名农垦医院 广东茂名 525200
通讯作者：刘志辉

中国结核杆菌利福平耐药株rpoB基因531、526、516位点碱基突变特点

曹翌明 李 丽 孟繁荣 刘志辉
BASE MUTATION CHARACTERISTICS IN THE POINTS OF 531, 526 AND 516 OF RPOB GENE OF RIFAMPICIN-RESISTANT TUBERCULOSIS BACILI STRAINS 
CAO YiMing, LI li, MENG Fanrong, et al

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 【摘 要】 目的 深入了解中国结核杆菌利福平耐药株rpoB基因531、526、516三个高突变率发生位点的碱基突变特点，为全面理解结核杆菌利福平耐药机制提供科学依据。方法 计算机检索PubMed数据库，对截止2015年3月31日发表的中国结核杆菌利福平耐药株rpoB基因突变研究的文献数据进行整合分析。结果 纳入分析文献49篇，获得3 319株利福平耐药结核杆菌rpoB基因各位点碱基突变的详细信息，其中257株（7.74%）未检测到突变、3 062株（92.26%）检测到rpoB基因突变。在3 062株rpoB基因突变株中：531、526、516位点突变的发生率分别为54.44%（1 667/3 062）、27.07%（829/3 062）和8.92%（273/3 062）；531位点碱基突变以TCG/TTG突变为主，占93.58%（1 560/1 667）；526位点碱基突变主要有CAC/GAC、CAC/TAC、CAC/CGC、CAC/CTC、CAC/AAC等类型，分别占33.53%（278/829）、26.30%（218/829）、1327%（110/829）、10.13%（84/829）、8.08%（67/829）；516位点碱基突变主要有GAC/GGC、GAC/GTC、GAC/TAC等类型，分别占35.53%（97/273）、35.53%（97/273）、16.85%（46/273）。结论 中国结核杆菌利福平耐药株rpoB基因531、526、516位点碱基突变以单碱基突变为主，突变率最高的531位点碱基突变主类型较为单一，而526、516位 碱基突变主类型则相对分散。
  【关键词】 结核杆菌,rpoB基因,利福平,耐药,循证分析
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.07.003

  利福平（rifampicin，RFP）作为目前结核病短程化疗的关键药物，其主要作用机制为与结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）RNA聚合酶β亚单位结合而干扰转录和RNA延伸。MTB对RFP产生耐药主要因其编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB基因突变所致，这已是不争的事实，并由此开发了多种RFP耐药分子检测方法［1］。这些方法的研究及其逐步应用，为我们掌握MTB rpoB基因突变的分子特征及它们与耐药表型之间的关系积累了丰富的资料。但是单个研究往往样本量较小，菌株代表性也不强，难能从中抽象出MTB rpoB基因突变的总体特征。遵从当今日益推崇的循证医学理念，于2013年开始我们即对PubMed数据库中MTB rpoB基因突变研究文献予以密切关注，并对中国MTB株的研究数据进行循证分析［2-3］。在分析RFP耐药MTB株rpoB基因507-533位利福平耐药决定区（rifampin resistance-determining region，RRDR）序列突变特征（相关数据另文发表）过程中，我们发现其531、526、516位点的基因突变各具其特点，现报道如下。
     1 资料与方法
1.1 文献纳入与排除标准 纳入标准：①研究对象为包括中国大陆及香港、澳门、台湾来源的RFP耐药MTB株；②研究菌株RFP耐药表型明确；③基因突变位点、碱基与氨基酸变化等突变信息均有良好提供。排除标准：①重复报道文献；②二次研究文献；③中、英文以外其它语种发表的文献。
1.2 文献检索 以“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND China”、“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Hong Kong”、“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Macon”和“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Taiwan”检索式在Pubmed数据库中检索，末期检索日期为2015年3月31日。
1.3 文献筛选 严格按照纳入和排除标准筛选文献，2名专业人员独立阅读所获文献的题目和摘要，在排除明显不符合纳入标准的文献后，对可能符合纳入标准的文献查阅（对Pubmed数据库中非免费全文文献借助广东省科技图书馆原文传递系统公共平台获得）并研读全文，以确定其是否真正符合纳入标准。 
1.4 数据提取 由2名专业人员独立选择文献、提取资料并交叉核对，意见不一致时由第三位研究者决定取舍。提取的主要资料包括：第一作者姓名、研究机构、Pubmed标识码PMID、文献发表年度、菌株来源、研究菌株总数以及突变类型、位点、碱基变化、氨基酸（AA）变化、突变株数量（N）等。
1.5 统计学分析 对纳入研究文献的基因突变计数资料信息进行合并计算。
     2 结果
2.1 纳入研究的基本特征 依检索策略检出130篇文献，通过阅读文题与摘要31项研究明显不符合文献纳入标准；对所剩99篇文献进行全文查找、研读全文，最终49篇文献纳入本研究（包括中文12篇、英文37篇），获得3 319株利福平耐药结核杆菌中国株rpoB基因各位点碱基突变的详细信息。纳入文献的基本情况见表1。

表1 纳入文献的基本情况

 

序号	PMID1)	菌株 来源2)	菌株 数量3)	序号	PMID	菌株 来源	菌株 数量	序号	PMID	菌株 来源	菌株 数量
1	10502914	台湾	50	18	17897230	河南	52	35	22325117	重庆	168
2	11601331	北京	45	19	18422555	浙江	49	36	22333499	广东	137
3	11758172	上海	17	10	18600483	北京	97	37	22553245	江西	77
4	11880449	大陆等①	45	21	18642656	上海	66	38	22858446	台湾	22
5	12356458	河南等②	193	22	18653966	四川	60	39	22931875	安徽	31
6	12490124	上海	23	23	18722102	北京	15	40	23149305	四川	214
7	12621089	台湾	63	24	19628903	广东	27	41	23208715	北京	24
8	12624020	上海	39	25	19725469	浙江	102	42	24326341	湖北	60
9	12734282	浙江等③	72	26	19799146	安徽	31	43	24419342	福建等④	128
10	14761721	上海	53	27	20008778	上海	241	44	24449341	广东	26
11	15196345	北京	70	28	20367954	甘肃	17	45	24574296	北京	65
12	15472360	湖北	56	29	20426983	安徽	34	46	24725975	上海	169
13	16496057	台湾	41	30	20491829	重庆	30	47	25040060	重庆	208
14	16776449	香港	214	31	20708497	天津	63	48	25465521	19省⑤	53
15	16954287	山东	55	32	20979796	上海	10	49	25566860	西藏等⑥	87
16	17061099	北京	73	33	22253562	浙江	46
17	17402201	福建	47	34	22321711	北京	102

 注：1)PMID：为pubmed收录文章的唯一标识码，可在pubmed检索系统中输入该标识码查阅具体文献；2)菌株来源中的等省具体名称：①大陆、台湾，其中大陆未指明省份；②河南、河北、山东、江西、安徽、上海、北京；③浙江、江苏、广西、吉林、安徽；④福建、贵州、广西、山西、上海、西藏；⑤福建、广东、广西、湖南、湖北、江西、重庆、河南、安徽、浙江、上海、甘肃、西藏、河北、北京、山西、陕西、辽宁、黑龙江；⑥西藏、湖南、新疆、河南、四川、安徽。3)为该项研究菌株的总数量，但有的研究不一定都给出了碱基突变信息，故其加和大于本文分析菌株的数量。
2.2 3 319株利福平耐药结核杆菌中国株rpoB基因531、526、516位点碱基突变情况在3 319株利福平耐药结核杆菌中国株中，257株未检测到rpoB基因任何位点的突变，占7.74%；其余3 062株（92.26%）则在rpoB基因的不同位点检测到多种不同类型的突变。在3 062株rpoB基因突变株中：531、526、516位点突变的发生率分别为54.44%（1 667/3 062）、27.07%（829/3 062）和8.92%（273/3 062）；531位点碱基突变以TCG/TTG突变为主，占93.58%（1 560/1 667）；526位点碱基突变主要有CAC/GAC、CAC/TAC、CAC/CGC、CAC/CTC、CAC/AAC等类型，分别占33.53%（278/829）、26.30%（218/829）、13.27%（110/829）、10.13%（84/829）、8.08%（67/829）；516位点碱基突变主要有GAC/GGC、GAC/GTC、GAC/TAC等类型，分别占35.53%（97/273）、35.53%（97/273）、16.85%（46/273）。具体情况见表2。
3 讨论
     对于MTB RFP耐药的分子机制，迄今已经基本阐明，人们研究发现约95%左右的RFP耐药菌株中存在rpoB基因突变，且多发生在rpoB507～533位27个氨基酸密码子（81bp）组成的区域（即前述的利福平耐药决定区RRDR）内，这与我们对4149株利福平耐药MTB株rpoB基因RRDR序列的循证分析结果（9364%）相近（相关数据另文发表），但是有文献报道531、526、516位点的突变率分别为39.9%、34.2%和7.5%［4］，与本文的54.44%、27.07%和8.92%有较大的差别，尤其是531位点。这可能是此文献给出的为来自全球研究报道的综合信息，而本分析结果则是特对中国MTB菌株而言，那么其中又蕴藏着一些令人深思的问题。
     依据进化论的观点突变应是一种不受环境影响的随机发生过程，这已得到彷徨变异实验和影印平板等实验的证实［5］。从本质上讲，细菌耐药基因突变属于一种进化形式，其突变模式也应遵从随机过程的一般规律。但关于耐药结核病发生的一般机制，则有优势学说和顺次选择学说认为：结核杆菌在繁殖过程中，极少菌株自然突变形成耐药菌，在抗结核药物选择性压力存

表2 3062株中国利福平耐结核杆菌rpoB基因531、526、516位点突变情况

 

531位点	526位点	516位点
突变率顺位	突变类型	AA变化	N	%	突变率顺位	突变类型	AA变化	N	%	突变率顺位	突变类型	AA变化	N	%
531单位点					526单位点					516单位点
	TCG/TTG	S/L	1532	91.90		CAC/GAC	H/D	266	32.09		GAC/GTC	D/V	90	32.97
	TCG/TGG	S/W	66	3.96		CAC/TAC	H/Y	202	24.37		GAC/GGC	D/G	49	17.95
	TCG/TAC	S/Y	7	0.42		CAC/CGC	H/R	98	11.82		GAC/TAC	D/Y	31	11.36
	TCG/TAT	S/Y	6	0.36		CAC/CTC	H/L	73	8.81		GAC/TTC	D/F	6	2.20
	TCG/TGT	S/C	3	0.18		CAC/AAC	H/N	46	5.55		GAC/AAA	D/K	1	0.37
	TCG/TTT	S/F	3	0.18		CAC/TGC	H/C	18	2.17		GAC/AAC	D/N	1	0.37
	TCG/ACG	S/T	2	0.12		CAC/CCC	H/P	13	1.57		GAC/ACC	D/T	1	0.37
	TCG/CAG	S/Q	2	0.12		CAC/TTC	H/F	7	0.84		GAC/CCC	D/P	1	0.37
	TCG/TAG	S/终止码	2	0.12		CAC/CAG	H/Q	5	0.60		GAC/GCC	D/A	1	0.37
	TCG/TTC	S/F	2	0.12		CAC/GGC	H/G	5	0.60	516+其它位点
	TCG/ATG	S/M	1	0.06		CAC/GTC	H/V	5	0.60		GAC/GGC	D/G	48	17.58
	TCG/GCG	S/A	1	0.06		CAC/AGC	H/S	3	0.36		GAC/TAC	D/Y	15	5.49
531+其它位点						CAC/CTT	H/L	2	0.24		GAC/GCC	D/A	10	3.66
	TCG/TTG	S/L	26	1.56		CAC/GCC	H/A	2	0.24		GAC/AAC	D/N	8	2.93
	TCG/TGG	S/W	6	0.36	526+其它位点						GAC/GTC	D/V	5	1.83
	TCG/TTC	S/F	3	0.18		CAC/AAC	H/N	21	2.53		GAC/GTC	D/G	2	0.73
	TCG/TTG	S/L	2	0.12		CAC/TAC	H/Y	16	1.93		GAC/CAC	D/H	1	0.37
	TCG/ACG	S/T	1	0.06		CAC/CGC	H/R	12	1.45		GAC/GAA	D/E	1	0.37
	TCG/GGG	S/G	1	0.06		CAC/GAC	H/D	12	1.45		GAC/TTC	D/F	1	0.37
	TGC/TGT	C/C	1	0.06		CAC/CTC	H/L	11	1.33		GAC缺失	Asn缺失	1	0.37
531位点总计						CAC/CAG	H/Q	4	0.48	516位点总计
	TCG/TTG	S/L	1560	93.58		CAC/CAA	H/Q	3	0.36		GAC/GGC	D/G	97	35.53
	TCG/TGG	S/W	72	4.32		CAC/ACC	H/T	1	0.12		GAC/GTC	D/V	97	35.53
	TCG/TAC	S/Y	7	0.42		CAC/AGC	H/S	1	0.12		GAC/TAC	D/Y	46	16.85
	TCG/TAT	S/Y	6	0.36		CAC/CCC	H/P	1	0.12		GAC/GCC	D/A	11	4.03
	TCG/TTC	S/F	5	0.30		CAC/CGA	H/L	1	0.12		GAC/AAC	D/N	9	3.30
	TCG/TGT	S/C	4	0.24		CAC/GCC	H/A	1	0.12		GAC/TTC	D/F	7	2.56
	TCG/TTT	S/F	3	0.18	526位点总计						GAC/AAA	D/K	1	0.37
	TCG/ACG	S/T	2	0.12		CAC/GAC	H/D	278	33.53		GAC/ACC	D/T	1	0.37
	TCG/TAG	S/终止码	2	0.12		CAC/TAC	H/Y	218	26.30		GAC/CAC	D/H	1	0.37
	TCG/ACG	S/T	1	0.06		CAC/CGC	H/R	110	13.27		GAC/CCC	D/P	1	0.37
	TCG/ATG	S/M	1	0.06		CAC/CTC	H/L	84	10.13		GAC/GAA	D/E	1	0.37
	TCG/CAG	S/Q	1	0.06		CAC/AAC	H/N	67	8.08		GAC缺失	Asn缺失	1	0.37
	TCG/CAG	S/Q	1	0.06		CAC/TGC	H/C	18	2.17
	TCG/GCG	S/A	1	0.06		CAC/CCC	H/P	14	1.69
	TCG/GGG	S/G	1	0.06		CAC/CAG	H/Q	9	1.09
						CAC/GCC	H/A	8	0.97
						CAC/TTC	H/F	7	0.84
						CAC/GTC	H/V	5	0.60
						CAC/AGC	H/S	4	0.48
						CAC/CAA	H/Q	3	0.36
						CAC/CTT	H/L	2	0.24
						CAC/ACC	H/T	1	0.12
						CAC/CGA	H/R	1	0.12

(下转第12页)(上接第9页)
在情况下，此种自然突变发生的频率可能增加［6］。这就说明：在危及细菌生命安全的情形之下，突变似乎并不完全随机，而有定向突变的倾向。这对我们深刻理解不同报道间上述位点突变率之间的差异也许有益。我们也许可以如此朴素地思维：531位的丝氨酸是RFP最为关键的作用的靶位，MTB在531位产生碱基突变是其最为直接和简化的"趋利避害"方式。另一方面，我们知道：在生物界中，各种生物采用较为通用的遗传达室法则，即应用64上可能的三联体密码子中的61个编码20种不同的氨基酸，为降低突变对物种变化的影响，一种氨基酸可能由几个密码子编码，编码同一氨基酸的多个密码子仅在第三位碱基上存在差异［7］。但我们可以从表2看到：MTB rpoB基因531、526、516三个位点发生同义突变（即单独第三碱基突变）的几率近乎为零，而多为第一、第二碱基的单碱基突变，这也说明MTB的耐药基因突变并非随机，而是以较为特定的方式。此种特定的方式我们可以总结为：①碱基突变多导致有义突变；②尽力避开其本身的基因复制"纠错机制"，以单碱基突变为主。我们认为：在强大的抗结核药物环境压力下，MTB以此种最为"经济"而简约的方式达则可较高效率地达到基因突变的目标以利于其生存，符合生物进化的一般原则。此种推测是否妥当，有等更进一步的研究予以证实。
     从表2还可看到：突变率最高的531位点碱基突变主类型较为单一，而526、516位 碱基突变主类型则相对分散。为何如此？目前我们不得而知。至于531、526、516位点与其它位点的联合突变，由于发生率不高，本文未进行详尽分析。这些都有待人们进行深入探索。

参考文献
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