肠镜活检新旧性石蜡标本中Bcl-2、Bax、Caspase-3抗原表达的比较

基金项目：广州市中医药、中西医结合科研项目（编号：2008B02）
江桂英 陈小玲 吕永慧 周丽梅 江 沂 王 倩：广州市中医医院 广东广州 510130
通讯作者：王 倩

肠镜活检新旧性石蜡标本中Bcl-2、Bax、Caspase-3抗原表达的比较

江桂英 陈小玲 吕永慧 周丽梅 江 沂 王 倩
COMPARISON OF EXPRESSIONS OF BCL-2 AND BAX, CAPASE-3 ANTIGEN IN SHORT TERM PARAFFIN SPECIMENS BY COLONOSCOPY BIOPSY
JIANG Guiying, CHEN Xiaoling, LV Yonghui, et al

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  【摘 要】 目的 探讨新旧性石蜡标本检测细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在溃疡性结肠炎（UC）中的抗原表达研究意义。方法 选择2006~2010年这5年内的新旧石蜡组织，根据临床病理学类型设置UC活动期、UC缓解期、正常对照组三组，应用免疫组织化学SP方法，测定Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达，并进行比较分析。 结果 各组标本的蛋白表达分布均相同，无统计学意义（p＞0.05）。 结论 2006~2010年这5年内新旧蜡块的Bcl-2、Bax、Caspase-3免疫组化表达没有明显差异，对临床UC的科学研究均具参考意义。
  【关键词】 溃疡性结肠炎,新旧蜡块,免疫组化,Bcl-2,Bax,Caspase-3

  【Abstract】 Objective To investigate the significance of the expressions of Bcl-2 and Bax proteins that detect and regulate apoptosis, Capase-3 antigen in the short-term paraffin specimens in ulceration colitis. Methods The short term paraffin tissues from 2006 to 2010 were selected and divided into three groups, including the ulceration colitis activity group, the ulceration colitis remission group and the normal group based on the clinicopathological type. The expressions of Bcl-2, Bax and Caspase-3 proteins were detected by immunohistochemical SP method and analyzed comparatively. Results The protein expressions in three groups were distributed at the same level (p>005). Conclusion The immunohistochemical expressions of Bcl-2, Bax, Caspase-3 in the short term paraffin specimens have no significant difference in the five years from 2006 to 2010, which provides a reference value for clinical research of ulcerative colitis.
     【Key words】  Cerative colitis, Short-term paraffin, Immunohistochemical, Bcl-2, Bax, Caspase-3
     【Author′s address】 Guangzhou Hospital of TCM, Guangzhou 510130, Guangdong Province, China
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.05.004

  目前，免疫组织化学技术在临床病理诊断中起着重要作用，而对于在一些过往病理诊断，若病例有新进展或有争议，需要重新用旧石蜡检测免疫组化；或某些科研教学上必须用往年陈旧病例的情况下，怎么样的操作方法和年限才具一定的诊断和研究价值，需要不断摸索和实践，事实上过于陈旧的石蜡组织检测某些相关抗体往往不太理想，结果仅呈弱阳性或检测不出来［1］。但在一定年限内的旧石蜡组织用于免疫组织化学的检测时，如果操作方法正确，还是可以具有可信性和理想的效果。我们回顾分析选取2006~2010年内新旧性石蜡的标本，依据临床病症特点分为三个组别，根据2003年中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会制定的溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）中西医诊治方案（草案）中西医证候诊断标准［2］进行分型，分为UC的活动期、缓解期和正常组，对三个组别共同进行Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的检测。检测过程中注重在抗原修复上，采用柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0），提高修复温度并适当增加修复时间，静置时间延长，自然静置冷却可让抗原充分暴露后，严格执行免疫组化标准化操作，同等条件下设阳性、阴性、空白对照，最终的检测效果令人满意。
     1 资料与方法
1.1 一般资料
     检测组织来自广州市中医医院病理科2006~2010年内，本院消化内科门诊与住院的患者确诊为UC，均符合2000年成都全国慢性炎病性肠病学研究会制定的UC诊断标准。选取2006～2009年间UC活动期石蜡标本30例，男16例，女14例;年龄22~70岁，平均450岁。2008～2010年间UC缓解期标本18例，男8例，女10例;年龄25~72岁，平均39.7岁。2008~2010年间正常结肠粘膜作为对照组标本15例，其中男9例，女6例;年龄26~78岁，平均53.2岁。正常对照组结肠黏膜标本均经病理学检查确诊为正常组织。
1.2 主要试剂 
     所有试剂均由中杉生物技术公司提供：SP二步方法，即用型，DAB显色剂，鼠抗人Bcl-2单克隆抗体，鼠抗人Bax单克隆抗体，鼠抗人Caspase-3单克隆抗体。
1.2.1 免疫组织化学法 将石蜡组织3~4 μm厚度切片，60 ℃温箱烤片1 h，行脱蜡，梯度酒精，蒸馏水充分冲洗干净。加入pH 6.0柠檬酸钠修复液中，微波高档加热至100 ℃后，调节至中档加热恒定在95~100 ℃温度30 min，离开加热源。自然至室温内冷却，放置过程大约1 h左右。PBS漂洗，3%过氧化物酶阻断液室温孵育10 min酶消化，滴加一抗，设置阳性对照、阴性对照，空白对照，而空白对照用PBS冲洗液（pH 7.4）滴加作为一抗。37 ℃温箱温盒中放置1 h，PBS冲洗3次，每次3 min，加增强剂孵育20 min，PBS冲洗3×3 min，二抗孵育30 min。PBS冲洗3×3 min，DAB显色10 min。苏木素复染、脱水、透明中性树胶封片。
1.2.2 免疫组化结果和判读 所有免组片都同一条件设置的光学显微镜下观察。胞浆中发现棕黄色颗粒为阳性细胞。
     结果判读［3］：（-）为阴性,表示全片没有胞浆中含棕黄色颗粒的细胞；弱阳性（+）表示胞浆中含棕黄色颗粒的细胞数量占全片的1%～25%；阳性（+ +）为26%～50%；强阳性（+ + +）为51%～75%或以上。
1.3 统计分析及结果记录
     应用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计分析，数据资料为频数表资料，统计方法采用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验，a=0.05为差异有统计学意义。
     2 结果
2.1 UC活动期组阳性细胞分布情况
     尚不能认为各年份标本的各种蛋白表达有统计学差异（p＞005），即可认为各年份标本的Bcl-2蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达分布相同（详见表1）。

表1 UC活动期阳性细胞分布情况

年份	例数	Bcl-2	Bax	Caspase-3
		-	弱+	+	++	+++	-	弱+	+	++	+++	-	弱+	+	++	+++
2009	9	0	1	4	3	1	0	1	3	3	2	0	0	3	5	1
2008	9	0	1	5	3	0	0	2	3	2	2	0	1	5	2	1
2007	6	0	3	3	0	0	0	0	1	4	1	0	0	1	3	2
2006	6	0	1	4	1	0	0	1	2	3	0	0	0	1	5	0
合计	30	0	5	16	7	1	0	4	9	12	5	0	1	10	15	4
 2		5.95	2.06	4.83
P		0.114	0.559	0.185

2.2 UC缓解期组阳性细胞分布情况
     尚不能认为各年份标本的各种蛋白表达有统计学差异（p＞0.05），即可认为各年份标本的Bcl-2蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达分布相同。（详见表2）

表2 UC缓解期阳性细胞分布情况

年份	例数	Bcl-2	Bax	Caspase-3
		-	弱+	+	++	+++	-	弱+	+	++	+++	-	弱+	+	++	+++
2010	6	0	0	5	1	0	0	0	4	2	0	0	0	0	5	1
2009	7	0	0	4	3	0	0	0	2	5	0	0	0	0	6	1
2008	5	0	0	4	1	0	1	2	1	1	0	0	0	2	2	1
合计	18	0	0	13	5	0	1	2	7	8	0	0	0	2	13	3
2		1.24	5.63	1.42
P		0.538	0.060	0.491

2.3 正常对照组阳性细胞分布情况统计如下
     尚不能认为各年份标本的Bcl-2蛋白、Bax 蛋白和Caspase-3蛋白表达有统计学差异（p＞0.05），即可认为各年

份标本的Bcl-2蛋白、Bax 蛋白和Caspase-3蛋白表达分布相同。（详见表3）

表3 正常对照组阳性细胞分布情况

年份	例数	Bcl-2	Bax	Caspase-3
		-	弱+	+	++	+++	-	弱+	+	++	+++	-	弱+	+	++	+++
2010	5	0	2	2	1	0	0	3	2	0	0	0	0	1	4	0
2008	10	0	3	3	4	0	0	3	5	2	0	0	1	2	7	0
合计	15	0	5	5	5	0	0	6	7	2	0	0	1	3	11	0
2		0.42	1.62	0.23
P		0.517	0.203	0.635

3 讨论
     免疫组化技术除在日常临床病理诊断中发挥至关重要的作用外，也在科研方面扮演重要角色。在现今的某些科研项目中，若受限于搜集足够的新鲜石蜡标本，只能用陈旧蜡块代替时，就会促使我们去摸索最佳年限的陈旧石蜡抗原保存状态，并研究比较找出最好的检测方法。病理样本处理中，组织固定的好坏是影响免疫组化结果的最关键因素［4］，病理标本多采用10%中性甲醛固定，在组织固定过程中，组织中的蛋白质分子交联增加，抗原被封闭，较大程度上影响免疫组化结果。本研究选取2006~2010这5年内的陈旧石蜡进行细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的免疫组化试验，所以在选择组织固定好、年份不一、同种病例的石蜡做免疫组时，修复时间、温度及pH值是试验成功的关键因素。有研究报道［5-7］：加热可以消解蛋白质间的交联，充分暴露抗原决定簇使抗原被激活，因此抗原修复可以直接影响到免疫组化的最终实验结果。而影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，修复时的温度越低则需要修复的时间越长；反之，如果修复时间不够长的话，免疫组化所显示的可能是修复后暴露的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原，其染色结果可能会非常弱或出现假阴性［8］。有文献报道［9-10］大多数陈旧石蜡需用高pH（9.0）高压修复才可以取得较好的染色效果，而微波热修复操作方便，且修复时间可做到严格标准化，因此我们选择了微波热修复［11］。本研究使用pH 6.0柠檬酸盐缓冲液微波加热延长修复时间大于30分钟作为实验条件，柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)的优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体，可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液［12］。结果显示大部分抗体表达稳定，证明实验条件改善有助于得出更稳定可靠的实验结果，而不必拘束于己有文献推荐的修复时间和pH限制。
     根据三个组的统计结果，可认为UC活动期、UC缓解期、正常对照组各组标本的不同年限的石蜡样本中各种蛋白表达相同，即用一定年限内的陈旧性石蜡包埋组织检测细胞调亡调控蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3，其结果表现稳定且具一定的可信度，结合临床诊断符合度高，具有临床研究意义。

参考文献
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