脑钠肽基因多态性与先天性心脏病易感性的相关性研究

基金项目：惠州市科技计划项目（编号:20130805）
陈惠英 李连欢：惠州市博罗县中医医院 广东惠州 516100
钟丽云：惠州市博罗县慢性病防治站 广东惠州 516100
刘锦光：惠州市中心人民医院 广东惠州 516001

脑钠肽基因多态性与先天性心脏病易感性的相关性研究


陈惠英 李连欢 钟丽云 刘锦光
ASSOCIATION OF GENETIC POLYMORPHISM IN BRAIN NATRIURETIC PEPTIDE GENE ANDTHE SUSCEPTIBILITY OF CONGENITAL HEART DISEASES
CHEN Huiying, LI Lianhuan, ZHON Liyun, et al

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  【摘 要】 目的 研究博罗地区人群中脑钠肽(NPPB)基因的SNP位点(rs198389和 rs198388)与先天性心脏病易感性的相关性。方法 利用多重SNaPshot技术，检测30例先天性心脏病患者和30例正常对照NPPB基因SNP位点(rs198389和 rs198388)的基因型，评价NPPB基因多态性位点与先天性心脏病遗传易感性的相关性。结果 NPPB基因rs198389位点3种基因型(AA、AG和GG)分布频率在CHD病例组中分别为433%、367%和200%，与对照组相比差异有统计学意义(p＜005)，AG基因型和GG基因型均能增加先天性心脏病的发病风险(OR=376，95%CI=214~502；OR=225，95%CI=105~334)；NPPB基因rs198388位点的基因型(AA和GG)分布频率在CHD病例组中分别为200%和633%，与对照组相比差异有统计学意义(p＜005)，GG基因型能增加先天性心脏病的发病风险(OR=568，95%CI=486~705)。结论 博罗地区人群中，脑钠肽(NPPB)基因的SNP位点(rs198389和 rs198388)与先天性心脏病的遗传易感性相关。
  【关键词】 脑钠肽基因,单核苷酸多态性,先天性心脏病遗传易感性

  【Abstract】 Objective To study the correlation between brain natriuretic peptide (NPPB) SNP genes (rs198389 and rs198388) and the susceptibility of congenital heart diseases in the population of Boluo County. Methods NPPB gene SNP locus (rs198389 and rs198388) genotypes of 30 cases of congenital heart diseases and the normal control group with 30 cases were detected with multiple SNaPshot technique. Results The distribution frequencies of 3 genotypes of AA, AG and GG in rs198389 locus of NPPB gene in the CHD group were 433%, 367% and 20%, which had a significant difference compared with the control group (p<005). AG and GG genotypes increased the onset risk of congenital heart disease (OR=376, 95%CI=214~502; OR=225, 95%CI=105~334).The distribution frequencies of AA and GG genotypes in rs198388 locus of NPPB gene in the CHD group were 20% and 633%, which had a significant difference compared with the control group (p<005). GG genotype increased the onset risk of congenital heart disease(OR=568, 95%; CI=486~705). Conclusion In the population of Boluo County, brain natriuretic peptide (NPPB) SNP genes (rs198389 and rs198388) can be associated with congenital heart diseases.
     【Key words】  Brain natriuretic peptide(BNP), Single nucleotide polymorphism (SNP), Congenital heart disease (CHD), Genetic susceptibility
     【Author′s address】 Huizhou Boluo County Hospital of Traditional Chinese Medicine, Huizhou 516100, Guangdong Province, China
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.01.006

  先天性心脏病(Congenital Heart Disease，CHD) 是指胎儿时期心脏血管发育异常导致的心血管结构、功能、代谢上的异常，其种类繁多，致死率高，严重危害患者的生命和健康。CHD 是人类发病率最高的出生缺陷，在我国的发生率约为8‰左右，每年新增病例13万以上［1-2］。除少数 CHD 是单基因突变和染色体畸变所致，大多数 CHD 属于多基因遗传病，是遗传因素与环境因素共同作用的结果［3］。
     脑钠肽是一种心脏神经激素，是含32个氨基酸的多肽，主要由心室肌合成和分泌，反映心室功能［4］。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，人类基因组中总共有300万个SNP，平均每1 000个碱基中就有一个SNP。SNP是人类基因组中密度最大的遗传标记，发生频率较高，被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记。众多研究表明，脑钠肽(NPPB)基因的多态性与糖尿病、高血压、心肌梗塞、心力衰竭等疾病密切相关，研究人员已将脑钠肽基因作为心血管疾病遗传易感性的重要候选基因之一［5-6］。
     本研究针对博罗地区人群进行脑钠肽基因(NPPB基因)的SNP位点(rs198389和 rs198388)与先天性心脏病易感性的关联研究，以便进一步明确与先天性心脏病有关联的易感位点，为先天性心脏病的诊断提供更客观准确的依据，有利于我国先天性心脏病高危人群的早期筛查、及早治疗和预防。
     1 材料与方法
1.1 材料
     选取2011年1月~2013年12月在我院心内科就诊的先天性心脏病患者 30例为病例组，年龄不限，男女不限；所有患者的诊断均符合先天性心脏病的诊断标准。此外，选取30例与患者处于同期的、性别、年龄相匹配的正常健康体检者作为对照组。两组在性别、年龄、病情等一般资料上比较差异无统计学意义（p<005）。所有受检者相互间无血缘关系，抽血前签署知情同意书，填写一般资料调查表，并采集空腹外周血2 ml，血样由枸橼酸抗凝管收集，于-70℃保存，用于基因组DNA的提取。
1.2 多重SNaPshot检测脑钠肽基因多态性
1.2.1 基因组DNA的抽提 采用Tiangen公司TIANamp Blood DNA Kit，从抗凝外周血中得到并纯化基因组DNA。
1.2.2 引物设计及合成 选取NPPB基因的SNP位点rs198389和 rs198388为研究靶点，采用sequenom Assay Design 31软件设计PCR扩增及延伸引物。每个SNP设计3条引物，2条引物是目的片段的扩增引物，长度在200~500 bp左右，Tm值在60度左右，第3条引物用于延伸ddNTP，设计在SNP位点的上游或者是反向的下游(表1)。引物由上海英骏生物公司（invitrogen）合成。

表1 PCR扩增引物序列表

Gene ID	rs198389	rs198388
引物1(F)	5′-GTCTCCCGCTTCTTCCTTTCC-3′	5′-GAGTTTTTAATGCTCTGAAATGTTATT-3′
引物2(R)	5′-CAGGAAGAAAGCGCCAACCTA-3′	5′-TAGCTGAGACCTGAAAGCAATAATC-3′
引物3	5′-TTTTTTTTAAATGTCCAGGTGTCC-3′	5′-TTTTTTTAATATETEAAGCAETTGAGG-3′

1.2.3 PCR扩增反应 PCR反应体系为15 μl：10×缓冲液 15 μl；dNTP混合物(10 mmol/L) 03 μl；MgCl2(25 mmol/L) 09 μl；HotstarR Taq DNA聚合酶 01 μl；PCR引物(10 pmol/L) 05 μl；DNA模板(20 mg/L) 1 μl。
     多重PCR反应程序：95℃变性15 min，94℃变性40 s，63℃退火1 min，每个循环下降05℃；72℃延伸15 min，15个循环；94℃变性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸15 min，25个循环；最后72℃延伸8 min。
     PCR产物纯化：在15 μl PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U ExoⅠ酶，震荡混匀，37℃保温1 h，75℃保温15 min以灭活酶，纯化产物于4℃保存24 h或-20℃长期保存。
1.2.4 SNaPshot反应 将纯化完毕的PCR产物、SNaPshot引物混合物(02 μmol/L)和SNaPshot荧光混合物组成反应体系。
     SNaPshot反应程序：96℃预变性10 s，96℃变性10 s，53℃退火5 s，60℃延伸30 s，25个循环；最后60℃延伸30 s。SNaPshot PCR产物按上述方法纯化。
1.2.5 测序 将纯化后的SNaPshot产物稀释20倍。样品体系按Hi-Di Formamide(高纯甲酰胺) 86 μl；GeneScan-120 LIZ Size Standard 09 μl；SNaPshot产物 05 μl。95℃ 变性5 min，迅速冰冷4 min。在ABI 3730XL型DNA序列检测仪上进行毛细管电泳。每个毛细管电泳样本中都加入了LIZ－120内标，使延伸片段的长度大小可以精确定位。测序完毕使用GeneMapper40软件分析测序结果。
1.3 统计学分析
     分析脑钠肽基因多态性与先天性心脏病易感性的相关性，并统计病例组和对照组SNPs分布频率，经Hardy-Weinberg平衡检验SNP基因型和等位基因频率分布是否具有群体代表性。软件分析后输出数据结果用SPSS 130统计软件分析，两组之间的SNPs分布频率差异用2检验。用二分类变量logistics回归方法结合不同的遗传模型进行统计，找到符合该位点的遗传方式，在病例组和对照组有统计学差异的情况下，计算不同基因型在疾病发病中风险值。所有检验均为双侧概率检验，以p<005为差异具有统计学意义。
     2 结果
2.1 NPPB基因位点的测序结果
     经GeneMapper4.0软件处理，BNP基因的两个SNP位点rs198389和 rs198388的测序结果SNaPshot图像如图1所示。

图1 位点rs198389和 rs198388的基因分型
2.2 NPPB基因多态性与CHD易感性的关联分析
     如表2所示，NPPB基因rs198389位点3种基因型(AA、AG和GG)分布频率在CHD病例组中分别为433%、367%和200%，与对照组(767%、133%和100%)相比，差异有统计学意义(p＜005)。CHD病例组的A和G等位基因频率为617%和383%，与对照组(817%和183%)相比，差异有统计学意义(p＜005)。
     
  采用二分类变量logistics回归方法，评价rs198389多态性与先天性心脏病易感性的相关性。与AA基因型相比，AG基因型和GG基因型均能增加先天性心脏病的发病风险(OR=376，95%CI=214~502；OR=225，95%CI=105~334)；与A等位基因型相比，G等位基因增加先天性心脏病的发病风险(OR=277，95%CI=142~425)。

表2 rs198389位点基因型和等位基因分布

n(%)

SNP	组别	样本数目	基因型	等位基因
			AA	AG	GG	GG+AG	A	G
	病例组	30	13(43.3)	11(36.7)	6(20.0)	17(56.7)	37(61.7)	23(38.3)
	对照组	30	23(76.7)	4(13.3)	3(10.0)	7(23.3)	49(81.7)	11(18.3)
	2	-	6.944	4.356	1.176	7.151	5.91	6.037
rs198389	OR		0.23	3.76	2.25		0.36	2.77
	(95% CI)	-	(0.11，0.36)	(2.14，5.02)	(1.05，3.34)	-	(0.15，0.54)	(1.42，4.25)
	p	-	< 0.001	< 0.05	< 0.05	< 0.001	< 0.05	< 0.05

  如表3所示，NPPB基因rs198388位点的基因型(AA和GG)分布频率在CHD病例组中分别为200%和633%，与对照组(500%和233%)相比，差异有统计学意义(p＜005)。CHD病例组的A和G等位基因频率为283%和717%，与对照组(600%和400%)相比，差异有统计学意义(p<0001)。
     采用二分类变量logistics回归方法，评价rs198388多态性与先天性心脏病易感性的相关性。与AG基因型和AA基因型相比，GG基因型能增加先天性心脏病的发病风险(OR=568，95%CI=486~705)；与A等位基因型相比，G等位基因增加先天性心脏病的发病风险(OR=379，95%CI=216~458)。

表3 rs198388位点基因型和等位基因分布

n(%)

SNP	组别	样本数目	基因型	等位基因
			AA	AG	GG	GG+AG	A	G
	病例组	30	6(20.0)	5(16.7)	19(63.3)	24(80.0)	17(28.3)	43(71.7)
	对照组	30	15(50.0)	8(26.7)	7(23.3)	15(50.0)	36(60.0)	24(40.0)
rs198388	2	-	5.934	0.884	9.774	6.032	12.119	11.973
	OR		0.25	0.55	5.68		0.26	3.79
	(95% CI)	-	(0.10，0.38)	(0.35，0.68)	(4.86，7.05)	-	(0.12，0.39)	(2.16，4.58)
	p	-	< 0.05	> 0.05	< 0.001	< 0.05	< 0.001	< 0.001

3 讨论
     心脏病是威胁人类健康的第一杀手，世界卫生组织称它为“时代的瘟疫”。先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)是目前儿童非感染性疾病的主要死因，因此加强先天性心脏病的诊断，对于改善患者的愈后，提高生存率，改善生活质量具有重要的意义。众多研究结果表明，基因的多态性与CHD的发生有着密切的关系，对相关基因多态性与CHD相关性的研究，可为 CHD 的发生机理、早期诊断、遗传干预和预后评估提供理论依据。
     近年来研究发现，脑钠肽基因(NPPB基因)的单核苷酸多态性与众多疾病的发生发展都相关。NEWTON-CHEH等在14 473个欧洲人中对 NPPA和NPPB基因进行研究发现，NPPA-NPPB rs5068、rs198358 和 rs632793 的多态性与患者血清中ANP、BNP水平及血压变化相关［7］。LAJER等在164名I型糖尿病患者中发现NPPB基因rs198389和 rs198388的多态性与血清中NT-proBNP相关［8］。在博罗人群中研究脑钠肽基因多态性，利用多重SNaPshot技术的优势，筛选得到基因型和基因频率具有群体代表性，且位点在病例组和对照组之间的分布频率存在显著差异的脑钠肽基因单核苷酸多态性位点，并获得位点最符合的遗传模型，以及位点不同基因型在疾病发病中的风险值（95%置信区间），从而确定可能提高先天性心脏病风险的基因型。本研究采用病例-对照的研究方法，通过对30例先天性心脏病患者，和30例正常对照NPPB基因的两个SNP位点(rs198389和 rs198388)的基因分型发现NPPB基因rs198389位点AG基因型和GG基因型均能增加先天性心脏病的发病风险；NPPB基因rs198388位点的GG基因型能增加先天性心脏病的发病风险。从而确定NPPB基因rs198389、rs198388多态性与博罗地区人群先天性心脏病的易感性相关。
     总之，脑钠肽基因(NPPB基因)多态性与先天性心脏病易感性的相关性研究，进一步提高了对CHD分子学机制的理解，同时对CHD风险人群的筛查、个体化预防、诊断和治疗具有重要的意义。但还需大样本、多地区及多基因的多态性联合研究及重复验证。

参考文献
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［2］ 刘 毅，李秀英，莫雪梅，等. 先天性心脏病相关易感基因的预测性研究［J］. 中国病理生理杂志，2011,27(5): 928-933.
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［4］ 徐名伟.血浆脑钠肽判断老年人心力衰竭严重程度及其预后的价值［J］.现代医院，2013,8(13):10-12.
［5］ 葛青玮，黄 洁，张 雷.新生儿心肌酶谱与血清N-端脑钠肽前体联合检测的意义［J］.国际检验医学杂志，2012,33(14):1740-1742.
［6］ 王爱萍，杨曙光，苏玉文，等.AMI患者血清NT-ProBNP与心肌酶水平的相关性研究［J］.泰山医学院学报，2006,27(6):555-597.
［7］ CHRISTOPHER NEWTON-CHEH, MARTIN G LARSON, RAMACHANDRAN S VASAN, et al. Association of common variants in NPPA and NPPB with circulating natriuretic peptides and blood pressure［J］. Nature Genetics, 2009, 41:348-353.
［8］ MARIA LAJER, LISE TARNOW, ANDERS JORSAL, et al. Polymorphisms in the B-type natriuretic peptide (BNP) gene are associated with NT-proBNP levels but not with diabetic nephropathy or mortality in type 1 diabetic patients［J］. Nephrol. Dial. Transplant, 2007, 22 (11): 3235-3239.